La tecnología de micro-matriz de fenotipo es un método efectivo de alto rendimiento que determina funcionalmente las actividades metabólicas celulares en respuesta a una amplia gama de metabolitos de entrada. La utilización en esta tecnología se mide en forma de respiración celular determinada por la cantidad de desarrollo de color producido por la reducción de NADH de un colorante redox a base de tetrazolio. En este trabajo, introduciremos el uso de ensayos de micro matriz de fenotipo en el contexto de microalgas utilizando especies modelo Chlamydomonas reinhardtii.
El objetivo de este estudio es establecer un método confiable para caracterizar el fenotipado metabólico de microalgas que se pueda utilizar para expandir los modelos de redes metabólicas de algas existentes o guiar la reconstrucción de nuevos modelos. La cepa CC-503 de Chlamydomonas reinhardtii se puede obtener en el centro de recursos de Chlamydomonas de la Universidad de Minnesota, Estados Unidos. Cultive las células en medios de grasa de fosfato de tris-acetato frescos hasta la fase de registro medio.
Revise las células bajo el microscopio para asegurarse de que estén en buena forma y sin ninguna contaminación. Gira hacia abajo la cultura a 2000 G-force durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante sin molestar el pellet.
Prepare medios de grifo frescos que contengan un colorante violeta D de tetrazolio al 0.1% Agregue diferentes antibióticos, incluidos Timentin, Ampicilina y Kanamicina a los medios para inhibir el crecimiento bacteriano. Los medios de grasa y este paso deben omitirse de los nutrientes, dependiendo de cada tipo de placa. Vuelva a suspender el pellet y el medio fresco del grifo a una concentración final de 1 millón de células por mililitro.
Use placas de ensayo de matriz de compuestos químicos, como fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, placas de fuentes de fósforo y azufre, y las fuentes de nitrógeno peptídico. Inocular 100 microlitros adecuados de medios autocontenentes en cada pozo de las placas de ensayo. Asegúrese de duplicar los ensayos.
Cabe señalar que en esta etapa, las células deben analizarse con tinción gramnegativa antes y después del ensayo para monitorear la contaminación bacteriana. Inserte las placas de ensayo de área de compuestos químicos en el sistema lector de microplacas. Incuba todas las placas a 30 grados durante un total de siete días y programa el sistema lector de microplacas para leer el cambio de color del tinte cada 15 minutos.
Como la mayoría de los lectores de microplacas no proporcionan una fuente de luz continua durante la incubación, las algas deberían poder llevar a cabo la respiración heterótrofa. Exporte los datos cinéticos sin procesar del lector de microplacas como archivos CSV, que posteriormente se utilizarán como entrada al paquete de software de microarrays de fenotipo y nuestro software. Para llevar a cabo el análisis de datos de microarrays de fenotipo, utilice el paquete de software OmniLog phenotype micro Erik OPM que se ejecuta dentro del entorno de software R.
En R studio, la interfaz gráfica de usuario para R, instale el paquete OPM y sus dependencias utilizando los comandos detallados en el manuscrito. Desplácese hasta el directorio que contiene los archivos CSV de los datos cinéticos e importe los datos mediante la función OPM de lectura. Los datos cinéticos se pueden agregar y discretizar utilizando la estimación de parámetros pref.
El uso de la gráfica de función XY permite mapear las mediciones de respiración o crecimiento en función del tiempo para las placas de ensayo de 96 podos. Los datos se pueden visualizar como un mapa de calor utilizando el gráfico de nivel de función para permitir una visión comparativa rápida de los datos cinéticos. El siguiente paso es identificar las reacciones y los genes asociados con los nuevos metabolitos.
En caso de presencia de un modelo existente para las algas, el análisis de datos del sistema de microarrays fenotipo se puede utilizar para refinar este modelo. Aquí presentamos la tubería que utilizamos para el refinamiento de la red metabólica a escala genómica para el modelo Chlamydomonas utilizando datos de microarrays de fenotipo. Cuando un nuevo compuesto da positivo para su utilización, los perfiles de reacción relevantes del compuesto se definen utilizando la base de conocimiento metabólico, proporcionando los números de comisión de enzimas asociados.
El primer paso es buscar en Kegg y MetaCyc para identificar los números de comisión de enzimas, CE, para las reacciones utilizando metabolizados encontrados de las matrices de compuestos químicos. A continuación, utilizamos los números CE identificados como base de búsqueda en múltiples recursos de anotación de algas disponibles, como el Instituto del Genoma Conjunto, JGI, Phytozome y publicaciones revisadas por pares. Las reacciones y metabolitos se agregan al modelo de red metabólica Chlamydomonas reinhardtii basado en COBRA, iRC1080, para expandir y refinar el modelo.
Si no se encuentra evidencia genética que respalde el número EC, se puede realizar una búsqueda basada en perfiles como NCBI Position-Specific Iterative, NCBI PSI-BLAST, para identificar genes candidatos asociados con la reacción. Los resultados se evalúan manualmente. Aquellos que pasan este paso de control de calidad con valores E inferiores a 0.05 para la relevancia de los números EC de búsqueda, se agregan al modelo métrico.
El último paso de este protocolo es refinar el modelo, evaluar y comparar los modelos. Utilice la última versión 3.0 de la caja de herramientas COBRA y la plataforma MATLAB para llevar a cabo los pasos para el refinamiento del modelo. Después de instalar la caja de herramientas cobra, puede descargar el modelo iRC1080.
Luego, en MATLAB, lo primero que debe hacer es navegar a la carpeta que contiene el modelo de referencia, iRC1080. Agregue las reacciones identificadas con sus genes asociados al modelo metabólico, como iRC1080, utilizando las funciones de la caja de herramientas Cobra. Agregue la reacción y cambie la asociación de genes.
Desplácese hasta el directorio que contiene el modelo iRC1080 y ejecute los comandos para cargar el modelo. Cámbiele el nombre y agregue una nueva reacción y su gen asociado. En algunos casos, cuando el metabolito no se produce intracelularmente, sino que se toma del medio, las reacciones de transporte para los nuevos metabolitos deben agregarse al modelo utilizando la función de reacción de adición / intercambio para ingresar o emitir el metabolito en el medio extracelular.
Pruebe el comportamiento del nuevo resultado y modelo, por ejemplo, iBD1106, realizando análisis de balance de flujo, FBA, utilizando la función optimizar el modelo CB en condiciones de luz y oscuridad para la maximización de la biomasa como función objeto. Entre otros, la solución de Logística de Amazon produce tres vectores: los flujos de reacción, los precios sombra del metabolito y los costos reducidos de reacción. Aquí, se proporciona un ejemplo donde el modelo iRC1080 se compara con su versión refinada, iBD1106, obteniendo los precios sombra que representan la sensibilidad de la función objetivo de biomasa a los cambios y metabolitos contabilizados en cada modelo.
Aquí mostramos gráficos de respiración XY y diagramas de nivel de las fuentes de carbono y las placas de ensayo de fuentes de nitrógeno para blanco y CC-503 en color verde azulado y púrpura, respectivamente. Dentro de cada pozo, las curvas de respiración representan la conversión del tinte por reducción en función del tiempo. El pico resaltado en el panel A representa la detección de acetato como la única fuente de carbono de esta placa, lo que es consistente con la literatura de Chlamydomonas.
La comparación del número de metabolitos identificados utilizando tres métodos diferentes, iRC1080, que es el modelo metabólico de Chlamydomonas bien curado, el tiempo de cromatografía de gases de vuelo GC-TOF y el ensayo de microarrays de fenotipo muestra que solo seis metabolitos se superponen entre los tres conjuntos, mientras que 149 fueron comunes entre iRC1080 y el conjunto de ensayos de microarrays de fenotipo. Esto muestra que, si bien cada tecnología tiene una fortaleza hacia la investigación de perfiles metabólicos, el conjunto de ensayos de microarrays de fenotipo puede ser una fuente significativa de nueva información metabólica. La información obtenida se utilizó para ampliar y refinar el modelo de red metabólica iRC1080.
Aquí, comparamos el contenido del modelo iRC1080 y el modelo expandido iBD1106, incluyendo el número de reacciones, el número de metabolitos y el número de genes. Mostramos que nuestra refinación de modelos agregó más de 254 reacciones a la nueva red resultante. Estas reacciones se clasifican en aminoácidos, dipéptidos, tripéptidos y reacciones de transporte.
Los metabolitos recientemente identificados se utilizaron para la expansión de la red metabólica y el refinamiento del modelo metabólico existente de Chlamydomonas reinhardtii. Los ensayos de microarrays de fenotipo se pueden utilizar para caracterizar fenotipos metabólicos de cepas existentes y recientemente aisladas. Además, el protocolo que utilizamos en el contexto de las microalgas puede guiar el refinamiento de modelos metabólicos de otras especies.
