Dieses Protokoll ist nützlich für die langfristige Erhaltung der Katzenoozyten durch eine Kryokonservierungstechnik, die als Verglasung bekannt ist, die für die Fruchtbarkeit und die Erhaltung der biologischen Vielfalt bei Tierarten von entscheidender Bedeutung ist. Die Hauptvorteile der Verglasung sind ihre Geschwindigkeit, da sie in weniger als 17 Minuten abgeschlossen werden kann, und ihre Durchführbarkeit unter Feldbedingungen, wenn flüssiger Stickstoff verfügbar ist. Die Hauskatze ist ein praktikables Modell für wild gefährdete Katzen.
Die Entwicklung und Optimierung von Kryokonservierungsprotokollen würde die Einrichtung von Gamete-Biobanken für Katzenschutzprogramme ermöglichen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung einer Repro Vitrifizierungsplatte mit drei konischen Brunnen in einer Reihe. Fügen Sie 20 Mikroliter Ausgleichslösung in den ersten Brunnen und 300 Mikroliter Verglasungslösung zu den zweiten und dritten Brunnen.
Um die Cumulus-Eizellenkomplexe oder COCs zu ausdemieren, verwenden Sie eine Pipetten mit kleinen Bohrungen, um einen oder mehrere Komplexe auf den Boden des ersten Brunnens zu übertragen. Fügen Sie langsam 20 Mikroliter Ausgleichslösung an die Grenze des Tropfens und warten Sie für drei Minuten, dann fügen Sie weitere 240 Mikroliter Gleichgewichtlösung und warten Sie für neun Minuten. Während des Wartens eine Schachtel mit flüssigem Stickstoff vorbereiten und eine Verglasungsunterstützung mit dem Experiment- oder Katzenidentifikationscode kennzeichnen.
Setzen Sie die Box und unterstützen Sie in der Nähe des Stereomikroskops. Nach dem Ausgleich der COCs, vitrifikieren Sie in weniger als 90 Sekunden. Um die COCs zu vitrifyn, füllen Sie die Kleinbohrpipette mit der Verglasungslösung aus dem zweiten Brunnen.
Nehmen Sie die COCs von der Unterseite des ersten Brunnens und bewegen Sie sie an die Oberfläche des zweiten Brunnens. Waschen Sie die Pipette mit der Verglasungslösung, dann bewegen Sie die COCs in einen anderen Bereich des Brunnens und mischen Sie die umgebende Lösung. Füllen Sie die Pipette mit Lösung aus einem anderen Bereich des Brunnens.
Bewegen Sie die COCs und mischen Sie das Medium, das sie umgibt, mit der Pipette. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch einmal. Als nächstes waschen Sie die Pipette mit der Verglasungslösung aus dem dritten Brunnen und verwenden Sie sie, um die COCs auf den Boden des dritten Brunnens zu bewegen.
Mischen Sie erneut die umgebende Lösung. Nach dem Befüllen der Pipette mit Lösung aus einem anderen Bereich des Brunnens, bewegen Sie die COCs und mischen Sie die Lösung. Wiederholen Sie diesen Vorgang.
Füllen Sie die Pipettenspitze mit der Verglasungslösung aus einem anderen Bereich des Brunnens und laden Sie sie, um die COCs auf den Streifen der Verglasungsstütze in der Nähe der Spitze zu laden, dann das überschüssige Medium ansaugen. Tauchen Sie sofort die Verglasungsstütze in flüssigen Stickstoff ein und verwenden Sie Klemmen, um sie zu schließen, um sicherzustellen, dass sie eingetaucht bleibt. Bewahren Sie die geladenen Verglasungsstützen in einem Kelchen auf und bewahren Sie sie bis zur Erwärmung in einem flüssigen Stickstofftank auf.
Stellen Sie die Heizbühne in der Nähe des Stereomikroskops auf und schalten Sie sie auf 38 Grad Celsius ein. Den Deckel einer Petrischale auf der Bühne erwärmen und dann die Verglasungsstützen aus dem Lagertank in eine Box mit flüssigem Stickstoff geben. Bereiten Sie eine Reihe einer Repro-Platte für jede Verglasungsunterstützung vor, die erwärmt werden soll.
Fügen Sie 300 Mikroliter Verdünnungslösung in den ersten Brunnen und 300 Mikroliter Waschlösung zu den zweiten und dritten Brunnen. Nehmen Sie die Auftaulösung aus dem Inkubator und lassen Sie 100 Mikroliter auf den Deckel der Petrischale fallen. Verwenden Sie die Klemmen, um die Verglasungsunterstützung im Inneren des flüssigen Stickstoffs zu öffnen.
Legen Sie den Petrischalendeckel unter das Stereomikroskop, nehmen Sie dann schnell die Verglasungsstütze auf und tauchen Sie ihren Streifen in den Tropfen ein, indem Sie ihn bewegen, bis sich alle COCs lösen. Entfernen Sie die Unterstützung aus dem Drop, sobald sie leer ist, aber lassen Sie die COCs für eine Minute in der Auftaulösung. Füllen Sie eine Pipette mit Verdünnungslösung und verwenden Sie sie, um die COCs von der Auftaulösung tropfen auf den Boden des ersten Brunnens mit Verdünnungslösung zu bewegen.
Lassen Sie die COCs dort für drei Minuten. Waschen Sie die Pipette mit der Waschlösung aus dem zweiten Brunnen, dann nehmen Sie die COCs und bewegen Sie sie auf den Boden des zweiten Brunnens. Warten Sie fünf Minuten.
Waschen Sie die Pipette mit einer Lösung aus dem dritten Brunnen und verwenden Sie sie, um die COCs vom zweiten Brunnen an die Oberfläche des dritten Brunnens zu bewegen. Warten Sie, bis die COCs den Boden des dritten Brunnens berühren. Wiederholen Sie dann den Vorgang mit einem anderen Brunnenbereich.
Wenn sie fertig ist, waschen Sie die Pipette mit Kulturmedium und bewegen Sie die Eizellen zu einem Kulturgericht. Die überwiegende Mehrheit der Gameten überlebt nach Eizellenverglasung und Erwärmung nach diesem Protokoll. Ein repräsentatives Bild eines lebensfähigen vitrifizierten gewimserten Katzenkumulus-Oozytenkomplexes, der mit Fluorescein-Diacetat und Propidiumjodid befleckt ist, ist hier zu sehen.
Diese Tabelle zeigt den Prozentsatz des Überlebens nach der Vitrifizierung, der Daten von Eizellen nach der Erwärmung darstellt, die für die In-vitro-Reifung bestimmt sind. Von 435 Eizellen überlebten 395, was insgesamt 90,8 % der Lebensfähigkeit nach der Erwärmung entspricht. Allerdings können einige morphologische Veränderungen nach der Erwärmung bemerkt werden.
Die häufigsten morphologischen Anomalien sind Veränderungen in der Ooplasmaform und Granulation, teilweiser oder manchmal vollständiger Verlust von Cumuluszellen und Zona pellucida Frakturen. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, denken Sie daran, Medien im Voraus vorzubereiten, damit sie die richtige Temperatur vor dem Gebrauch sind, und Protokolltemperaturen und -zeiten zu befolgen, um Zelltoxizität zu vermeiden. Das Protokoll könnte auch auf Eizellen anderer Arten angewendet werden.
Im Erfolgsfalle könnte dies auch zum Keimplasma-Banking zur Erhaltung der biologischen Vielfalt in gefährdeten Katzen beitragen.
