Questo protocollo è utile per la conservazione a lungo termine degli ovociti felini attraverso una tecnica di crioconservazione nota come vetrificazione, che è cruciale per la fertilità e la conservazione della biodiversità nelle specie animali. I principali vantaggi della vetrificazione sono la sua velocità poiché può essere completata in meno di 17 minuti e la sua fattibilità in condizioni di campo se è disponibile azoto liquido. Il gatto domestico è un modello praticabile per i felini selvatici in via di estinzione.
Lo sviluppo e l'ottimizzazione dei protocolli di crioconservazione consentirebbero di stabilire biobanche gamete per programmi di conservazione felina. Inizia preparando una piastra di vetrificazione Repro con tre pozzi conici in una riga. Aggiungere 20 microlitri di soluzione di equilibrazione al primo pozzo e 300 microlitri di soluzione di vetrificazione al secondo e al terzo pozzo.
Per equilibrare i complessi di ovocite cumulos, o COC, utilizzare una pipetta a piccolo foro per trasferire uno o più complessi sul fondo del primo pozzo. Aggiungere lentamente 20 microlitri di soluzione di equilibrazione al bordo della goccia e attendere tre minuti, quindi aggiungere altri 240 microlitri di soluzione di equilibrazione e attendere nove minuti. Durante l'attesa, preparare una scatola con azoto liquido ed etichettare un supporto di vetrificazione con l'esperimento o il codice di identificazione del gatto.
Metti la scatola e il supporto vicino al microscopio stereo. Dopo aver equilibrato i COC, eseguire la vetrificazione in meno di 90 secondi. Per vetrificare i COC, riempire la pipetta a piccolo foro con la soluzione di vetrificazione dal secondo pozzo.
Prendi i COC dal fondo del primo pozzo e spostali sulla superficie del secondo pozzo. Lavare la pipetta con la soluzione di vetrificazione, quindi spostare i COC in un'altra area del pozzo e mescolare la soluzione circostante. Riempire la pipetta con soluzione da un'altra area del pozzo.
Spostare i COC e mescolare il mezzo che li circonda con la pipetta. Ripetere questo processo ancora una volta. Quindi, lavare la pipetta con la soluzione di vetrificazione dal terzo pozzo e utilizzarla per spostare i COC sul fondo del terzo pozzo.
Ancora una volta, mescolare la soluzione circostante. Dopo aver riempito la pipetta con soluzione da un'altra area del pozzo, spostare i COC e mescolare la soluzione. Ripetere questo processo.
Riempire la punta della pipetta con la soluzione di vetrificazione da un'altra area del pozzo e utilizzarla per caricare i COC sul nastro del supporto di vetrificazione vicino alla punta, quindi aspirare il mezzo in eccesso. Immergere immediatamente il supporto di vetrificazione in azoto liquido e utilizzare morsetti per chiuderlo, assicurandosi che rimanga immerso. Conservare i supporti di vetrificazione caricati in un calice e conservarli in un serbatoio di azoto liquido di stoccaggio fino al riscaldamento.
Posizionare lo stadio di riscaldamento vicino al microscopio stereo e accenderlo a 38 gradi Celsius. Scaldare il coperchio di una piastra di Petri sopra il palco, quindi trasferire i supporti di vetrificazione dal serbatoio di stoccaggio a una scatola con azoto liquido. Preparare una fila di una piastra Repro per ogni supporto di vetrificazione da riscaldare.
Aggiungere 300 microlitri di soluzione di diluizione al primo pozzo e 300 microlitri di soluzione di lavaggio al secondo e al terzo pozzo. Togliere la soluzione di scongelamento dall'incubatrice e far cadere 100 microlitri sul coperchio della piastra di Petri. Utilizzare i morsetti per aprire il supporto di vetrificazione all'interno dell'azoto liquido.
Posizionare il coperchio della piastra di Petri al microscopio stereo, quindi raccogliere rapidamente il supporto di vetrificazione e immergere la sua striscia nella goccia, spostandolo fino a quando tutti i COC si staccano. Rimuovere il supporto dalla goccia non appena è vuoto, ma lasciare i COC nella soluzione di scongelamento per un minuto. Riempire una pipetta con soluzione di diluizione e utilizzarla per spostare i COC dalla soluzione di scongelamento cadere sul fondo del primo pozzo con soluzione di diluizione.
Lasciare i COC lì per tre minuti. Lavare la pipetta con la soluzione di lavaggio dal secondo pozzo, quindi prendere i COC e spostarli sul fondo del secondo pozzo. Aspetta cinque minuti.
Lavare la pipetta con una soluzione dal terzo pozzo e utilizzarla per spostare i COC dal secondo pozzo alla superficie del terzo pozzo. Attendere che i COC tocchino bene la parte inferiore del terzo pozzo. Quindi ripetere il processo con un'altra area del pozzo.
Al termine, lavare la pipetta con un mezzo di coltura e spostare gli ovociti in un piatto di coltura. La stragrande maggioranza dei gameti sopravvive dopo la vetrificazione e il riscaldamento degli ovociti secondo questo protocollo. Qui è mostrata un'immagine rappresentativa di un valido complesso di ovocite cumulo di gatto riscaldato vetrificato macchiato di diacetato di fluoresceina e ioduro di propidio.
Questa tabella mostra la percentuale di sopravvivenza dopo la vetrificazione, che descrive i dati post-riscaldamento degli ovociti destinati alla maturazione in vitro. Su 435 ovociti, 395 sopravvissero, segnando una redditività complessiva del 90,8% dopo il riscaldamento. Tuttavia, alcuni cambiamenti morfologici possono essere notati dopo il riscaldamento.
Le anomalie morfologiche più frequenti sono i cambiamenti nella forma e nella granulazione dell'ooplasma, la perdita parziale o talvolta totale di cellule cumuliformi e le fratture della zona pellucida. Quando si tenta questa procedura, ricordarsi di preparare i supporti in anticipo in modo che siano la temperatura giusta prima dell'uso e di seguire le temperature e i tempi del protocollo per evitare la tossicità cellulare. Il protocollo potrebbe essere applicato anche agli ovociti di altre specie.
In caso di successo, ciò potrebbe anche contribuire alla banca del plasma germinale per la conservazione della biodiversità nei felini in via di estinzione.
