פרוטוקול זה שימושי לשימור ארוך טווח של הביציות החתוליות באמצעות טכניקת קריו-שימור הידועה בשם vitrification, החיונית לשימור פוריות ומגוון ביולוגי במין בעלי חיים. היתרונות העיקריים של vitrification הם המהירות שלה מאז זה יכול להסתיים בתוך פחות מ 17 דקות ואת ההיתכנות שלה בתנאי שדה אם חנקן נוזלי זמין. החתול הביתי הוא מודל בר קיימא לחתולים בסכנת הכחדה פראית.
פיתוח ואופטימיזציה של פרוטוקולי cryopreservation יאפשרו הקמת ביובנקים gamete עבור תוכניות שימור חתולים. התחל על ידי הכנת צלחת vitrification Repro עם שלוש בארות חרוט בשורה אחת. הוסיפו 20 מיקרוליטרים של פתרון שיווי משקל לבאגם הראשון ו-300 מיקרוליטרים של פתרון ויטריפינציה לבאנות השנייה והשלישית.
כדי לצייד את קומפלקסים cumulus oocyte, או COCs, להשתמש פיפטה קטנה נשא להעביר קומפלקס אחד או יותר לתחתית הבאר הראשונה. לאט להוסיף 20 microliters של פתרון שיווי משקל לגבול של הירידה ולחכות שלוש דקות, ולאחר מכן להוסיף עוד 240 microliters של פתרון שיווי משקל ולחכות תשע דקות. בזמן ההמתנה, הכינו קופסה עם חנקן נוזלי ותייגו תמיכה בוויטריפיקציה עם הניסוי או קוד זיהוי החתול.
שים את התיבה ותמיכה ליד מיקרוסקופ הסטריאו. לאחר שיווי המשקל של ה- COCs, בצע vitrification בפחות מ- 90 שניות. כדי להפוך את ה- COCs לבלתי מוסריים, מלאו את הפיפיטה הקטנה בתסרון הוויטריפיקציה מה באר השנייה.
קח את ה- COCs מתחתית הבאר הראשונה והזז אותם אל פני השטח של הבאר השנייה. לשטוף את פיפטה עם פתרון vitrification, ולאחר מכן להעביר את COCs לאזור אחר של הבאר ולערבב את הפתרון שמסביב. מלאו את הפיפסה בפתרון מאזור אחר של באר.
להזיז את COCs ולערבב את המדיום המקיף אותם עם פיפטה. חזור על תהליך זה פעם נוספת. לאחר מכן, לשטוף את פיפטה עם פתרון vitrification מן הבאר השלישית ולהשתמש בו כדי להעביר את COCs לתחתית הבאר השלישית.
שוב, מערבבים את הפתרון שמסביב. לאחר מילוי פיפטה עם פתרון מאזור אחר של הבאר, להזיז את COCs ולערבב את הפתרון. חזור על תהליך זה.
מלא את קצה פיפטה עם פתרון vitrification מאזור אחר של הבאר ולהשתמש בו כדי לטעון את COCs על רצועת התמיכה vitrification קרוב לקצה, ולאחר מכן שאף את המדיום עודף. מיד לצלול את התמיכה vitrification בחנקן נוזלי ולהשתמש מלחציים כדי לסגור אותו, לוודא שהוא נשאר שקוע. יש לאחסן את תמיכות ההוויה הטעונות בזבל ולשמור אותן במיכל חנקן נוזלי לאחסון עד להתחממות.
מניחים את שלב החימום קרוב למיקרוסקופ הסטריאו ומדליקים אותו ל-38 מעלות צלזיוס. מחממים את המכסה של צלחת פטרי על גבי הבמה, ואז מעבירים את תמיכות הוויטריפיקציה ממיכל האחסון לקופסה עם חנקן נוזלי. הכן שורה אחת של צלחת Repro עבור כל תמיכה vitrification להיות מחומם.
הוסיפו 300 מיקרוליטרים של פתרון דילול לתיבה הראשונה ו-300 מיקרוליטרים של פתרון כביסה ל בארות השניה והשלישית. מוציאים את תספורת ההפשרה מהאינקובטור ומפילים 100 מיקרוליטרים על מכסה צלחת פטרי. השתמש מלחציים כדי לפתוח את התמיכה vitrification בתוך החנקן הנוזלי.
מניחים את מכסה צלחת פטרי מתחת למיקרוסקופ הסטריאו, ואז במהירות להרים את התמיכה vitrification לטבול את הרצועה שלה בירידה, להזיז אותו עד שכל COCs להתנתק. הסר את התמיכה מהירידה ברגע שהיא ריקה, אך השאר את ה- COCs בפתרון ההפשרה למשך דקה אחת. מלאו פיפסה בפתרון דילול ולהשתמש בה כדי להעביר את ה-COCs מירידה בפתרון ההפשרה לתחתית הבאר הראשונה עם פתרון דילול.
תשאיר את המנכ"לים שם לשלוש דקות. לשטוף את פיפטה עם פתרון לשטוף מן הבאר השנייה, ואז לקחת את COCs ולהזיז אותם לתחתית הבאר השנייה. חכה חמש דקות.
לשטוף את פיפטה עם פתרון מן הבאר השלישית ולהשתמש בו כדי להעביר את COCs מן הבאר השנייה אל פני השטח של הבאר השלישית. המתן עד ש- COCs יגעו בתחתית הבאר השלישית. לאחר מכן חזור על התהליך עם אזור באר אחר.
בסיום, לשטוף את פיפטה עם מדיום תרבות להעביר את oocytes לצלחת תרבות. הרוב המכריע של הגמטות שורדות לאחר התסיסה וההתחממות של הביציות על פי פרוטוקול זה. תמונה מייצגת של חתול מחומם קיימא קומולוס oocyte קומפלקס מוכתם ניקוד פלואורסין ו propidium יודיד מוצג כאן.
טבלה זו מציגה את אחוז ההישרדות לאחר vitrification, המתאר נתונים שלאחר התחממות של oocytes המיועדים התבגרות במבחנה. מתוך 435 בוציטים, 395 שרדו, עם 90.8% בסך הכל לאחר ההתחממות. עם זאת, ניתן להבחין בשינויים מורפולוגיים מסוימים לאחר ההתחממות.
החריגות המורפולוגיות השכיחות ביותר הן שינויים בצורת ooplasm וגרנולציה, אובדן חלקי או לפעמים מוחלט של תאי קומולוס, ושברים zona pellucida. בעת ניסיון הליך זה, זכור להכין מדיה מראש, כך שהם הטמפרטורה הנכונה לפני השימוש כדי לעקוב אחר טמפרטורות פרוטוקול ותזמונים כדי למנוע רעילות התא. הפרוטוקול יכול להיות מיושם גם על oocytes של מינים אחרים.
אם יצליח, זה יכול גם לתרום חיידקים פלסם בנקאות לשימור המגוון הביולוגי חתולים בסכנת הכחדה.
