El protocolo descrito aquí nos permite investigar la función de una quimiocina y el comportamiento de los macrófagos in vivo. La mayoría de los modelos experimentales existentes de quimiotaxis celular se basan en experimentos de células in vitro. Pero los experimentos in vitro a veces son demasiado simples para modelar el complejo entorno in vivo.
Además, es posible que no representen la capacidad de quimioatracción in vivo. Estos métodos utilizan la ventaja específica de los peces cebra para la observación directa del comportamiento celular, que es difícil para los ratones. Comience generando construcciones transgénicas TGFABP-10A interleucina-34.
Inyectar las construcciones de interleucina-34 FABP-10A en una etapa celular Tg(mpeg1:GFP)transgénica y un son embrión de peces de tipo salvaje junto con la MRNA transposasa. Levante y recoja los embriones de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Luego, fíjelos con 4%paraformaldehído durante la noche a 4 grados centígrados o durante dos horas a temperatura ambiente.
Después de la fijación, lave los embriones con PBST tres veces durante cinco minutos por lavado. Deshidratar los embriones por separado con 50%metanol en PBST, seguido de 100%metanol, luego cambiar a fresco 100%metanol, y almacenarlos en 20 grados Celsius negativos durante al menos 2 horas. Cuando esté listo para la hibridación de la sonda, rehidrate los embriones por separado en 50%metanol en PBST.
Luego, lávelos con PBST tres veces durante cinco minutos por lavado. Digerir los embriones con proteinasa K en PBST a temperatura ambiente. A continuación, deseche la solución de digestión y repita la fijación con un 4%de paraformaldehído durante 20 minutos a temperatura ambiente.
Después de la fijación, lave los embriones dos veces con PBST durante 10 minutos por lavado. Realice la prehibridación con búfer de hibridación calentada a 65 grados centígrados durante al menos una hora. Luego, precalienta la sonda de interleucina-34 a 65 grados Celsius durante 10 minutos.
Recicle el búfer de hibridación en el tubo original y realice la hibridación con la sonda precalentada a 65 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, lave los embriones con 50% de formamida y 2X SSCT seguido de 2X SSCT y luego 0.2X SSCT a 65 grados Celsius. Repita cada lavado tres veces con 20 minutos por lavado.
Luego, lave los embriones tres veces con PBST durante cinco minutos por lavado. Bloquee las muestras con 600 mililitros de tampón de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, añada 400 microlitros de solución de anticuerpos anti-digoxigenina HRP e incubar los embriones a cuatro grados centígrados durante la noche.
Al día siguiente, retire el anticuerpo y lave los embriones seis veces con PBST durante 20 minutos por lavado. Después del último lavado, enjuague cada muestra con 30 microlitros de 1X más diluyente de amplificación durante cinco minutos. Incubar las muestras en la solución de trabajo de tiramina fluorófora durante cinco a 15 minutos en la oscuridad.
Extender el tiempo de incubación a 30 minutos si las señales son débiles. Luego, lave los embriones con PBST tres veces durante 10 minutos por lavado. Y incubarlos con el anticuerpo primario a cuatro grados centígrados durante la noche.
Al día siguiente, lave los embriones cinco veces con PBST durante 30 minutos por lavado, e incubarlos con los anticuerpos secundarios a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, lave los embriones tres veces en PBST durante 10 minutos por lavado, y guárdelos en 70% de glicerol en la oscuridad a cuatro grados Celsius o 20 grados Celsius negativos durante más tiempo. Antes de la toma de imágenes, utilice un microscopio de fluorescencia para seleccionar los embriones DS rojos y GFP doble positivos.
Para montar el pescado, utilice un baño de metal para calentar un mililitro de 1% de agarosa de fusión baja por encima de 90 grados centígrados. Luego, enfríe a temperatura corporal y mezcle en 50 microlitros de 0.2%tricaine. Transfiera los embriones anestesiados a un pequeño plato montado con un portaobjetos en la parte inferior.
Retire el agua circundante y deje caer lentamente la baja agarosa de fusión en los embriones. Ajuste cuidadosamente la posición del pez antes de que la agarosa se haya solidificado, manteniendo el área del hígado cerca del portaobjetos. Una vez que la agarosa se haya solidificado, cúbrala cuidadosamente con otra capa de agarosa para reforzarla.
Coloque el plato en la mesa portadora del microscopio confocal, cubra el pescado con la solución E2 con tricaína y comience a tomar imágenes. Para operar el microscopio confocal, abra el software Zen Black 2.3 y haga clic en localizar, luego incubación y, a continuación, ajuste la temperatura a 29 grados centígrados. Haga clic en el menú de adquisición y seleccione el modo de escaneo y los láseres necesarios en el menú de configuración inteligente.
A continuación, seleccione Z-stack y posición. Haga clic en el menú del diseñador experimental y seleccione habilitar el experimento de varios bloques en el primer bloque para encontrar la muestra en la ampliación baja. A continuación, cambie a la ampliación alta y deje que el área observada en el centro del campo visual.
Establezca la posición y la información de la pila Z. A continuación, seleccione la intensidad del láser adecuada, las capas de escaneo y la velocidad de imagen. Una vez que todos los bloques están configurados, establezca el número adecuado de bucles y comience a grabar.
Este protocolo se utilizó para inyectar una interleucina-34 específica del hígado sobre el plásmido de expresión en embriones de peces transgénicos, que sus macrófagos fueron etiquetados con GFP. La hibridación in situ de fluorescencia de montaje completo y la inmunostaining se utilizaron para analizar la expresión de la interleucina-34 y los macrófagos etiquetados por la GFP. Los números de células de macrófagos se analizaron cuantitativamente en embriones no inyectados y construyeron embriones inyectados en la región hepática y de cola.
Las imágenes vivas se utilizaron para observar directamente los macrófagos, etiquetados de forma verde, pasando por el hígado de un pez de control y migrando al hígado de una interleucina-34 sobre la expresión de peces. Los pasos importantes de este protocolo incluyen la selección de una línea transgénica adecuada para etiquetar la célula de interés. Y el tejido adecuado para tomar imágenes de su expresión de gen transgénico, así como una ventana de tiempo de observación adecuada.
Esta técnica podría aplicarse para estudiar la función de otras quimioquinas en el comportamiento de otras células, como las células T y los neutrófilos in vivo.
