Reconocemos el apoyo del Consejo chino de becas (CSC) a J.Z. y al Cancer Genomics Centre Netherlands (CGC. NL) a P.t.D.

1. Análisis de la fosforilación SMAD2 inducida por TGF-β usando hinchazón occidental
NOTA: Las células MCF10A-Ras de mama humana premalignante se utilizaron como ejemplo para investigar las respuestas de señalización TGF-β33. En principio, los métodos descritos a continuación también son aplicables a otras líneas celulares sensibles a TGF-β.
<ol><li>Cultivo de la línea celular epitelial mamaria MCF10A-Ras a 37 °C en el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)/F12 que contiene L-glutamina con 5% suero de caballo, 20 factor de crecimiento epidérmico ng/mL (FEAG), 10 mg/ml de insulina, 100 ng/ml de enterotoxina de cólera, 0,5 mg/ml de hidrocortisona y 1:100 penicilina-estreptomicina (Pen-Strep).</li>
	<li>Pruebe las células MCF10A-Ras con 1 ml de 0.25% trypsin-EDTA durante 1 minuto y cuente células viables usando un contador de células.</li>
	<li>Células de semillas en placas de 6 pozos a una densidad de 5×105 celdas/pozo.</li>
	<li>Después del crecimiento nocturno, trate las células con TGF-β (5 ng/mL) o tampón de ligando (4 mM HCl, 0,1% albúmina sérica bovina libre de ácidos grasos (BSA)) durante 1 hora, y luego elimine el cultivo medio y lave suavemente las células dos veces con 1 ml de solución salina amortiguada por fosfato (PBS).</li>
	<li>Enfriar las células en placas de 6 pozos sobre hielo y añadir 150 μL de ensayo de precipitación inmunitaria por radio preenfriamiento (RIPA) tampón de lisis (150 mM NaCl, 0.1% Tritón X-100, 0.5% desoxicolato de sodio, 0.1% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, y cóctel de inhibidor de mini proteasa recién añadido). Deje que la lisis continúe sobre hielo durante 10 minutos.</li>
	<li>Raspe las células adherentes del plato usando un rascador de células de plástico, luego transfiera suavemente la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga precooled.</li>
	<li>Centrífuga la célula lysate durante 10 minutos a 150 fuerza centrífuga (x g) a 4 °C y transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga fresco de 1,5 ml.</li>
	<li>Mida la concentración de proteínas utilizando un kit de ensayo proteico compatible con detergente (CC).</li>
	<li>Cargue 30 μg de proteína de cada muestra en un gel de electroforesis de policristulación de sulfato de dodecilo sódico al 10% y ejecute el gel a un voltaje de 100 V durante 1,5-2 horas.</li>
	<li>Transfiera las proteínas del gel a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) de 45-μm a una tensión de 110 V durante 1-1,5 horas.</li>
	<li>Transfiera la membrana PVDF a un recipiente adecuado con el lado proteico (el lado que estaba mirando hacia arriba del gel) hacia arriba, y enjuague brevemente la membrana en agua destilada.</li>
	<li>Deseche el agua, agregue la solución Ponceau S y coloque la membrana en una plataforma de balanceo durante 1-2 minutos.</li>
	<li>Despresta la membrana con agua destilada enjuagando rápidamente y luego lavándola durante 1 minuto.</li>
	<li>A continuación, coloque la membrana PVDF en una caja de luz y tome una foto para comprobar si hay cargas totales de proteínas iguales.</li>
	<li>Lave la membrana con solución salina tamponada tris con Tween 20 (TBST, Tris-HCl de 20 mM, pH 7,4, NaCl de 150 mM y 0,1% Tween 20) hasta que no haya manchas visibles.</li>
	<li>Ponga la membrana en amortiguador de bloqueo (5% de leche descremada en solución TBST) e incubarla durante 1 hora a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave la membrana dos veces con TBST.</li>
	<li>Incubar la membrana con anticuerpos primarios contra fosfo-SMAD2 (p-SMAD2; 1:1000, hecho en casa 34),SMAD2/3 total 1:1000 y gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH; 1:1000), durante la noche a 4 °C.</li>
	<li>Lave la membrana dos veces con TBST e incubar la membrana con un anticuerpo secundario contra conejo o ratón (1:5000) durante 2 horas.</li>
	<li>Incubar la membrana PVDF con sustrato ECL occidental durante 30 segundos y detectar la señal utilizando un sistema de imágenes.</li>
	<li>Repita los experimentos al menos tres veces para obtener triplicatos biológicos.</li>
</ol>2. Análisis de las respuestas transcripcionales inducidas por TGF-β dependientes de SMAD3
<ol><li>Realice el ensayo de reportero transcripcional SMAD3/SMAD4 dependiente de12-luciferase.<ol>
<li>Cultivo y trypsinize células MCF10A-Ras como se describe en el paso 1. Sembrar células en placas de 24 pozos a 5×104 células/pozo y permitir que las células se adhieran durante la noche.</li>
		<li>Al día siguiente de la siembra, cotransfectar las células en cada pozo con 100 ng del TGF-β/SMAD3-inducible (CAGA)12 luciferasa transcriptional reportero construido35 y 80 ng de la β-galactosidasa expresión construcción utilizando polietilenimina (PEI). La transfección de β-galactosidasa se utiliza para normalizar las diferencias en la eficiencia de la transfección entre diferentes pozos. Configure todos los grupos experimentales en triplicado.</li>
		<li>Después de 24 horas de incubación, las células de hambre con glucosa dmem-alta sin suero y, 6 horas más tarde, añadir TGF-β (5 ng / mL) o tampón de ligando (4 mM HCl, 0.1% BSA) como un control del vehículo a las células.</li>
		<li>Después de otras 24 horas de incubación, lave las células dos veces con PBS preguerra.</li>
		<li>Añadir 120 μL/pozo 1× tampón de lisis y agitar suavemente la placa a 4 °C durante 20 minutos.</li>
		<li>Transfiera 30 μL de lisato a cada pozo de una microplaca de ensayo blanco de 96 pozos para medir la actividad luciferasa utilizando un luminosómetro.</li>
		<li>Transfiera 50 μL de lisato a cada pozo de una placa transparente de 96 pozos para medir la actividad β-galactosidasa.</li>
		<li>Normalizar la actividad luciferasa a la actividad β-galactosidasa y repetir los experimentos al menos tres veces para obtener triplicatos biológicos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analizar la expresión de los genes objetivo β TGF utilizando la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real (qRT-PCR).<ol>
<li>Cultivo y trypsinize células MCF10A-Ras como se describe en el paso 1. Sembrar células en placas de 6 pozos a 5×105 células/pozo y permitir que las células se adhieran durante la noche.</li>
		<li>Tratar las células con TGF-β (5 ng/mL) o búfer de ligando (4 mM HCl, 0.1% BSA) durante 6 horas, y luego lavar las células dos veces con 1 mL de PBS.</li>
		<li>Aísle el ARN total mediante un kit de aislamiento de ARN.</li>
		<li>Determine la concentración de ARN con un NanoDrop y realice la síntesis de cDNA con 1 μg de ARN utilizando un kit de síntesis cDNA de primera hebra.</li>
		<li>Utilice un sistema de detección de PCR en tiempo real para realizar PCR cuantitativo en tiempo real (qRT-PCR) con cDNA diluido diez veces en una mezcla de reacción de 10 μL que incluye imprimaciones específicas para el avance humano y el reverso para GAPDH (para la normalización), SERPINE1 (codificación de la proteína PAI-1, un gen objetivo TGF-β/SMAD), SMAD7 (gen objetivo TGF-β/SMAD) y qPCR Master Mix. Configure todos los grupos experimentales en triplicado. NOTA: Las secuencias de imprimación utilizadas para detectar genes humanos objetivo en qRT-PCR se enumeran en la Tabla 1.</li>
		<li>Utilice las siguientes condiciones de reacción qPCR: inicialización, 95 °C durante 3 minutos; desnaturalización, 95 °C durante 10 segundos; recocido, 60 °C durante 30 segundos; y extensión, 80 °C durante 10 segundos; desnaturalización, recocido y extensión se repiten 40 veces.</li>
		<li>Repita los experimentos al menos tres veces para obtener triplicatos biológicos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Análisis de TGF-β inducido EMT
<ol><li>Analice la expresión de los marcadores EMT a nivel proteico utilizando la hinchazón occidental. NOTA: El análisis de TGF-β-induced EMT se muestra utilizando células epiteliales NMuMG del ratón como ejemplo36,37.<ol>
<li>Cultivo NMuMG células a 37 °C en dmem-alto medio de glucosa complementado con 10% suero bovino fetal y 1:100 Pen-Strep. Utilice los métodos descritos en el paso 1 para el aislamiento y la detección de proteínas. NOTA: En este experimento se utilizan los siguientes anticuerpos: E-cadherin, 1:1000; N-cadherin, 1:1000; Caracol, 1:1000; , 1:1000; Tubulina, 1:1000 (Figura 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analice la expresión de los marcadores EMT en el nivel de ARNM utilizando el PCR cuantitativo en tiempo real como se describe en el paso 2.2. NOTA: Todas las imprimaciones del ratón utilizadas para qRT-PCR, incluido CDH1 (codificación de la proteína E-cadherin), SNAILy ZEB2 (Figura 3) se enumeran en la Tabla 1.</li>
	<li>Analice el proceso emt utilizando inmunofluorescencia indirecta y tinción directa de fluorescencia.<ol>
<li>Tinción indirecta de inmunofluorescencia de E-cadherin<ol>
<li>Coloque cubiertas de vidrio cuadrados estériles de 18 mm en placas de 6 pozos (una cubierta por pozo).</li>
			<li>Semilla 1×105 células NMuMG con 2 ml de DMEM completo por placa de 6 pozos y permitir que las células se adhieran durante la noche.</li>
			<li>Mueva suavemente las cubiertas con células adherentes a una nueva placa de 6 pozos y agregue 2 ml de medio de cultivo a los pozos.</li>
			<li>Tratar las células con TGF-β (5 ng/mL) o búfer de ligando (4 mM HCl, 0.1% BSA) durante 2 días.</li>
			<li>Retire el medio de cultivo y lave suavemente las células dos veces con 1 ml de PBS pre-warmed.</li>
			<li>Corrija las células añadiendo 1 ml de paraformaldehído e incubando durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, lave suavemente las células dos veces con 1 ml de PBS.</li>
			<li>Permeabilizar las células fijas con 0.1% Tritón X-100 durante 10 minutos a temperatura ambiente y lavar las células dos veces con PBS.</li>
			<li>Bloquee las células con 5% BSA en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente y lave las células dos veces con PBS.</li>
			<li>Agregue el anticuerpo primario contra E-cadherin (diluido 1:1000 en PBS) a la parte superior de cada tapadera e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente.</li>
			<li>Retire el anticuerpo primario y lave el tapatío con PBS tres veces.</li>
			<li>Agregue el anticuerpo secundario Alexa Fluor 555 (diluido 1:500 en PBS) a la parte superior de cada coverlip e incuba durante 1 hora a temperatura ambiente mientras cubre con papel de aluminio para protegerse de la luz.</li>
			<li>Retire el anticuerpo secundario y lave el tapatío con PBS tres veces.</li>
			<li>Monte el tubo de cubierta (celdas mirando hacia abajo) sobre toboganes de vidrio utilizando el medio de montaje con 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) y guarde las diapositivas montadas en una caja a 4 °C, protegidas de la luz.</li>
			<li>Observe la tinción con microscopía confocal SP8.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Tinción directa de fluorescencia de filamentos (F)-actina.<ol>
<li>Prepare muestras siguiendo los pasos 3.3.1.1. a 3.3.1.9.</li>
			<li>Mancha las células añadiendo Alexa Fluor 488 Phalloidin (1:1000) durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad para visualizar actina filamentosa (F-actin).</li>
			<li>Lave las células tres veces con PBS.</li>
			<li>Monte el tubo de cubierta en diapositivas de vidrio utilizando el medio de montaje con DAPI y tome imágenes con microscopía confocal SP8.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La señalización TGF-β/SMAD desempeña un papel fundamental en la progresión del cáncer de mama, ya que puede promover la invasión y metástasis de las células del cáncer de mama induciendo emt7. Aquí, describimos un flujo de trabajo lógico para investigar la señalización iniciada por TGF-β desde la activación SMAD inducida por receptores hasta las respuestas transcripcionales y biológicas mediadas por SMAD. Comenzamos describiendo el análisis de la fosforilación SMAD2, continuamos con respuestas transcripcionales inducidas por TGF-β dependientes de SMAD3 y expresión de marcador EMT tanto a nivel genético como proteico para analizar la respuesta de señalización TGF-β/SMAD, y finalmente examinamos la EMT inducida por TGF-β. Utilizamos el reportero transcripcional12-luciferase que contiene cajas derivadas del promotor PAI-1, para monitorear la actividad de la ruta de señalización TGF-β/SMAD35. Esta construcción de reportero requiere SMAD3 y SMAD4 para su activación. Estudios anteriores han demostrado que el derribo de SMAD4 atenuado TGF-β-inducido12-luciferasa actividad37. Además del ensayo del reportero, determinar el estado de fosforilación de los SMAD endógenos, incluidos SMAD2 y SMAD3, es otra forma de investigar la respuesta de señalización TGF-β. De hecho, otros miembros de la familia TGF-β, como el factor de crecimiento y diferenciación (GDF)-8/miostatina y GDF-9, también transducen señales a través de proteínas SMAD2/3 mediante la participación de TβRI42,43,44. Además del reporterode 12-luciferase, varios reporteros similares han sido utilizados para detectar la activación de la señalización TGF-β. Por ejemplo, un reportero transcripcional (SBE)4-Lux con elementos de respuesta derivados del promotor JunB puede ser inducido eficientemente por TGF-β, activins y BMPs45.
El blotting occidental y el qPCR se utilizaron para analizar la EMT inducida por TGF-β, que son métodos clásicos para investigar la expresión de marcadores epiteliales (es decir, E-cadherin) y marcadores mesenquimales (es decir, N-cadherin, Snail, Slug y Zeb2). También realizamos tinción indirecta de inmunofluorescencia de E-cadherin y tinción directa de fluorescencia de F-actin. Estos ensayos validaron aún más el fenotipo mesenquimal de las células después del tratamiento β TGF. La limitación de la tinción de inmunofluorescencia es que las células necesitan ser fijadas antes de la incubación con anticuerpos e imágenes, y es difícil investigar los cambios en la expresión del marcador EMT en las células vivas. Recientemente, el diseño de líneas celulares reporteras emt, como A549 pulmón adenocarcinoma-vimentina-RFP, ha hecho posible monitorear la transformación de células epiteliales a células mesenquimales en tiempo real a través de la expresión de proteína fluorescente roja (RFP) etiquetada vimentina. Esta plataforma podría ser utilizada para la detección de drogas y el desarrollo de nuevos fármacos46. LifeAct dye, un péptido de 17 aminoácidos, que puede manchar las estructuras de F-actin en las células vivas, se está convirtiendo en una valiosa herramienta para visualizar el citoesqueleto actin en tiempo real sin interferir con los procesos celulares47. En este estudio, utilizamos dos inhibidores de moléculas pequeñas, SB431542 y GW788388, para validar su efecto inhibitorio en la señalización β TGF y la EMT inducida por TGF-β. En particular, GW788388 inhibe poderosamente la actividad TβRI y TβRII, mientras que SB431542 tiene un efecto inhibitorio sólo en TβRI (y ALK4 y ALK7). Estudios anteriores revelaron que GW788388 es más potente in vivo que SB43154240. Además de la inhibición de emt, GW788388 redujo la expresión de marcadores de fibrosis en el riñón, y la administración oral de GW788388 en ratones diabéticos disminuyó notablemente la glomerulopatía25,48.
Emt desempeña un papel esencial en la promoción de la plasticidad de las células cancerosas y resulta en resistencia a los medicamentos y metástasis 49. Por lo tanto, se ha propuesto dirigirse a células derivadas de EMT con fármacos citotóxicos específicos50 o inducir la redifferentiation a través de la transición mesenquimal a epitelial (MET)51 como un enfoque para superar la metástasis de las células cancerosas y la resistencia a la terapia. Sin embargo, el MET contribuye a la proliferación de células cancerosas diseminadas en órganos distantes52,lo que podría ser contraproducente cuando se utiliza la reversión terapéutica de la EMT. Recientemente, un nuevo estudio informó de un enfoque de transdiferenciación terapéutica al dirigirse directamente a las células de cáncer de mama derivadas de EMT para la diferenciación en adipocitos30. El estudio de Ishay-Ronen et. 30 células de cáncer epitelial de murina Py2T utilizadas que habían sido sometidas a una transición a células mesenquimales en respuesta al tratamiento a largo plazo con TGF-β. Demostraron que la rosiglitazona en combinación con inhibidores de MEK mejoró la diferenciación epitelial y la adipogénesis. Sin embargo, encontramos que la rosiglitazona por sí sola era suficiente para inducir la transdiferenciación de células murinas py2T mesenquimales en adipocitos.
En resumen, los métodos utilizados en este estudio proporcionaron un flujo de trabajo lógico para investigar la señalización β TGF y la EMT inducida por TGF-β. Los dos inhibidores, SB431542 y GW788388, pueden bloquear las respuestas inducidas por TGF-β y la EMT. Además, también demostramos rosiglitazona solo induce adipogenesis en ciertas células de cáncer de mama mesenquimal inducida por TGF-β. Aunque utilizamos sólo varias líneas celulares de cáncer de mama para investigar las respuestas β TGF, los métodos descritos aquí podrían extrapolarse a otras células (cáncer). Aquí, utilizamos varias concentraciones de TGF-β para inducir respuestas celulares. En la mayoría de los tipos de células, TGF-β ejerce su actividad biológica en el rango de concentración de 0.01-10 ng/mL53 e induce la señalización en un patrón de dosis-respuesta. En las células endoteliales primarias, incluidas las células endoteliales aórticas bovinas, el TGF-β indujo la expresión sustancial de SMAD2 fosforilado a 0,025 ng/ml, alcanzó un máximo de 0,25 ng/ml, y se mantuvo en este nivel en respuesta a concentraciones más altas53. En nuestro estudio, utilizamos una alta concentración de células TGF-β (5 ng/mL) en MCF10A-Ras para el ensayo de reportero transcripcional para obtener respuestas fuertes. La fosforilación SMAD2 y la expresión génica objetivo pueden ser inducidas por TGF-β a una dosis baja; por lo tanto, utilizamos 2.5 ng / mL TGF-β para tratar las células. Sin embargo, la concentración de trabajo más adecuada depende del tipo de célula y los efectos estimados. Para determinar la mejor concentración de TGF-β, se recomienda tratar las células con diferentes dosis (de baja a alta).

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61830/studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal">Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>.&#160;NMuMG was mislabeled as&#160;cancer cells.
NMuMG cells are non-transformed epithelial breast cells established from a mouse mammary gland. NMuMG cells are frequently used as a model system to investigate TGF-&#946;-induced epithelial to mesenchymal transition (EMT). EMT is induced by TGF-&#946; in premalignant human MCF 10A-RAS (M2) cells and mouse MMTV-PyMT breast cancer cell line. The article has been updated to reflect this.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61830/studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal">Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>.&#160;NMuMG was mislabeled as&#160;cancer cells.

Erratum: Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

El factor de crecimiento transformador de citoquinas β (TGF-β) es el prototipo de un gran grupo de polipéptidos reguladores estructurales y funcionalmente relacionados, incluyendo TGF-βs (es decir, TGF-β1, -β2 y -β3), proteínas morfogénicas óseas (BMPs) y activinas1,2. Todas estas citoquinas desempeñan un papel importante en el desarrollo embrionario y en el mantenimiento de la homeostasis de tejidos y órganos3. La desregulación de TGF-β puede conducir a una gran variedad de enfermedades, incluyendo cáncer4,5. TGF-β desempeña un papel complejo y dual en la progresión del cáncer: en las células epiteliales normales y premalignantes, TGF-β se comporta como supresor de tumores inhibiendo la proliferación e induciendo la apoptosis6,7; sin embargo, en la etapa tardía de progresión tumoral, cuando las respuestas citostáticas están bloqueadas por la activación de oncogenes o la pérdida de genes supresores tumorales, TGF-β actúa como potenciador tumoral promoviendo la transición epitelial a mesenquimal (EMT) en las células cancerosas, permitiendo así la invasión y metástasis de las células cancerosas, actuando sobre las células en el microambiente tumoral, y estimulando la angiogénesis y la evasión inmune8,9,10.
TGF-β se secreta como una molécula precursora inactiva que contiene el terminal carboxímico maduro TGF-β y péptido asociado a la latencia (LAP)11. Este pequeño complejo puede estar covalentemente unido por proteína latente TGF-β-unión (LTBP)12. La liberación de TGF-β madura se puede mediar mediante la acción de proteasas específicas que cortan LAP o por el tirón mecánico de LAP en un proceso dependiente de la integrina13,14. Además de ltbp, Glycoprotein A repeticiones predominantes (GARP) se expresa altamente en la superficie de las células T reguladoras (Tregs) y desempeña un papel similar a LTBP en la regulación de la activación de TGF-β15,16. GARP se une directamente a TGF-β latente a través de la vinculación de disulfuro y la asociación novalente. La activación de TGF-β desde el complejo GARP/TGF-β requiere integrinas17. La β TGF madura se une a los receptores de serina/treonina quinasa β TGF, es decir, TGF-β receptores tipo I (TβRI) y TGF-β tipo II (TβRII)18 para iniciar la señalización. La vinculación de TGF-β a TβRII promueve la contratación de TβRI y la formación de un complejo heteromérico. Posteriormente, TβRI es fosforilado por TβRII quinasa en residuos de serina y trionina en un motivo corto rico en glicina y serina (GS), lo que resulta en su activación19,20. Tras la activación, TβRI activado recluta y fosforila sus sustratos: los dos SMAD específicos del receptor (R-SMADs) que incluyen SMAD2 y SMAD3 (Figura 1). R-SMADs comparten una estructura general similar con dos dominios de homología Mad, MH1 y MH2, que están separados por una región vinculador rica en pro línea (Figura 2). El motivo de unión al ADN dentro del dominio MH1 de SMAD3 no se conserva entre SMAD2 y SMAD3, y SMAD2 no puede enlazar directamente el ADN debido a dos inserciones en su dominio MH1 (exon 3 y L1). SMAD2 y SMAD3 se pueden activar mediante la fosforilación del motivo SSXS en su C-termini (Figura 2). Phosphorylated SMAD2/3 forma complejos heteroméricos con un mediador SMAD común, SMAD4, que se transloca en el núcleo para modular la transcripción de genes objetivo (Figura 1)7,21. Esta vía canónica de señalización SMAD está regulada con precisión y genera respuestas celulares y tisulares específicas como la regulación del destino celular y la metástasis de células tumorales y la invasión22. Además de la señalización TGF-β-SMAD, las vías de señalización no SMAD también pueden ser activadas directamente por los receptores para regular las respuestas celulares posteriores23.
Durante la progresión tumoral, se necesita la activación de vías inducidas por TGF-β dependientes de SMAD e independientes de SMAD para la inducción de EMT. Emt es un proceso reversible en el que las células tumorales se dedifferentian de un fenotipo epitelial, que se asocia con la pérdida de contactos célula-célula y disminución de la polaridad apical-basal, a un fenotipo mesenquimal con mayor motilidad y capacidad de invasión24. Emt se caracteriza por el aumento de la expresión de proteínas marcadoras mesenquimales, incluyendo N-cadherin, vimentina, Zeb2 y Snail1/2, y la regulación descendente concomitante de marcadores epiteliales, tales como E-cadherin y β-catenina (Figura 3)25. Sin embargo, la transición de un epitelial a un estado mesenquimal es a menudo incompleta, y las células obtienen características epiteliales y mesenquimales mixtas (E/M). Un documento reciente de la Asociación Internacional de EMT propuso describir el proceso de las células sometidas a estados fenotípicos E/M intermedios como plasticidad epitelial-mesenquimal (EMP)26. Esta plasticidad se refiere a emt parcial, un estado híbrido E/M, un estado EMT metástasis, un continuo EMT y un espectro EMT26. Durante la EMT, las células tumorales adquieren propiedades de células madre cancerosas (CSC) y se vuelven más resistentes a la apoptosis inducida pordesprendimientos 27. Mientras que emt es responsable de la adquisición de un fenotipo invasivo en las células tumorales primarias e impulsa la progresión del cáncer, en cambio, la transición mesenquimal-epitelial (MET) ha demostrado desempeñar un papel importante en el crecimiento de las células tumorales diseminadas en sitios metastásicos distantes28,29. Un estudio reciente demostró que las células de cáncer de mama derivadas de EMT pueden ser transdiferenciadas en adipocitos, lo que podría ofrecer una oportunidad para inhibir la metástasis y superar la resistencia terapéutica en las células tumorales y el cáncer recaída30. Debido al importante papel de la señalización TGF-β en la activación de emt en carcinogénesis mamaria, presentamos protocolos detallados para la hinchazón occidental, un ensayo de reportero transcripcional luciferasa, reacción cuantitativa en cadena de polimerasa en tiempo real (qRT-PCR) e inmunofluorescencia para la investigación de la señalización de TGF-β, EMT inducida por TGF-β, y la transdiferenciación de células tumorales epiteliales de mamas murinas derivadas de EMT en adipocitos. Estas técnicas son las herramientas analíticas más utilizadas en el campo de la biología celular. qRT-PCR se utiliza para detectar, caracterizar y cuantificar los niveles de expresión de ARNm de manera cuantitativa. En comparación con el PCR cuantitativo (qPCR), una técnica alternativa, la transcripción inversa (RT)-PCR se puede utilizar para determinar la expresión de ARNm de una manera semicuantitativa31,32. La hinchazón occidental se utiliza para examinar los niveles específicos de proteínas en una muestra de lisato celular dada con ventajas de sensibilidad y especificidad, de una manera semicuantitativa. Por lo tanto, presentamos un flujo de trabajo sistemático para analizar los cambios de la expresión génica a la expresión proteica para ayudar a investigar la señalización β TGF que también se puede aplicar a otras vías de señalización.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm-side square glass coverslips</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>631-1331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-E-cadherin antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) antibody</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-N-cadherin antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Slug antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SMAD2/3 antibody</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>610842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Snail antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tubulin antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera enterotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1705060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-high glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-high glucose medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11039047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>01-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S1860-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq qPCR Master Mix</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>A600X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>91077C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA II kit</td>
			<td>BIOKE&#180;</td>
			<td>740955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (Pen-Strep)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K1621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skimmed milk</td>
			<td>Campina: Elk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>17001402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>2030-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying tgf-&#946; signaling and tgf-&#946;-induced epithelial-to-mesenchymal transition in breast cancer and normal cells

Transformar el factor de crecimiento β (TGF-β) es un factor multifuncional secreto que desempeña un papel clave en la comunicación intercelular. Perturbaciones de la señalización β TGF puede conducir al cáncer de mama. TGF-β provoca sus efectos sobre la proliferación y la diferenciación a través de receptores específicos de superficie celular TGF-β tipo I y tipo II (es decir, TβRI y TβRII) que contienen un dominio intrínsico serina/trionina quinasa. Tras la formación de complejos heteroméricos inducidos por TGF-β, la señalización intracelular TβRI activada provoca mediante la fosforilización SMAD2 y SMAD3. Estos SMAD activados forman complejos heteroméricos con SMAD4 para regular genes objetivo específicos, incluyendo el inhibidor de activación plasminógeno 1 (PAI-1, codificado por el gen SERPINE1). La inducción de la transición epitelial a mesenquimal (EMT) permite que las células epiteliales del cáncer en el sitio primario o durante la colonización en sitios distantes obtengan un fenotipo invasivo e impulsen la progresión tumoral. TGF-β actúa como un potente inductor de la invasión del cáncer de mama mediante la conducción de EMT. Aquí, describimos métodos sistemáticos para investigar la señalización TGF-β y las respuestas EMT utilizando células MCF10A-RAS humanas premalignantes (M2) y células epiteliales NMuMG del ratón como ejemplos. Describimos métodos para determinar la fosforilación SMAD2 inducida por TGF-β mediante hinchazón occidental, actividad transcripcional dependiente de SMAD3/SMAD4 utilizando actividad de reportero luciferasa y expresión génica objetivo SERPINE1 mediante reacción cuantitativa en cadena de polimerasa en tiempo real (qRT-PCR). Además, se describen métodos para examinar la EMT inducida por TGF-β midiendo los cambios en la morfología, la expresión de marcador epitelial y mesenquimal, la tinción de actina filamentosa y la tinción de inmunofluorescencia de E-cadherin. Dos inhibidores selectivos de la quinasa del receptor TGF-β de molécula pequeña, GW788388 y SB431542, se utilizaron para bloquear la fosforilación SMAD2 inducida por TGF-β, los genes objetivo y los cambios en la expresión del marcador EMT. Además, describimos la transdiferenciación de células tumorales epiteliales de células epiteliales de mama mesenquimal en adipocitos. Los métodos para examinar la señalización inducida por TGF-β y la EMT en el cáncer de mama pueden contribuir a nuevos enfoques terapéuticos para el cáncer de mama.

Análisis de la señalización TGF-β El paso clave en la señalización TGF-β es la fosforilación de los dos residuos de serina terminal más carboxígenos en el motivo SSXS (Figura 2) por TβRI quinasa38,39. Para investigar las respuestas de señalización de TGF-β, realizamos la hinchazón occidental de SMAD2 fosforilado. En las células MCF10A-Ras de mama humana premalignante, la fosforilación de SMAD2 aumentó significativamente en respuesta a la estimulación de TGF-β durante 1 hora, mientras que la expresión del SMAD2/3 total no se vio afectada por el tratamiento con TGF-β(Figura 4A). Mediante el uso del ensayo de reportero transcripcional CAGA-luc inducido por TGF-β,4-driven CAGA-luc, encontramos que TGF-β indujo notablemente al reportero luciferasa en la línea de células MCF10A-Ras en comparación con las células no tratadas (Figura 4B). Además, observamos que los objetivos genéticos transcripcionales directos bien caracterizados de TGF-β incluidos SMAD7 y SERPINE1 (codificación de la proteína PAI-1), se expresaban en gran medida en las células MCF10A-Ras tratadas con TGF-β (Figura 4C).
Análisis de TGF-β inducido EMT Evaluamos TGF-β-inducido EMT con varios métodos, tales como cambios morfológicos, la expresión de marcadores EMT en los niveles de ARNm y proteínas y la tinción de inmunofluorescencia de los marcadores EMT36. Las células epiteliales NMuMG tratadas con TGF-β durante 1 y 2 días cambiaron de una morfología epitelial clásica a una morfología mesenquimal en forma de husillo, como se muestra en la microscopía de contraste de fase (Figura 5A). En consonancia con los cambios morfológicos, observamos que el tratamiento con TGF-β condujo a un aumento en la expresión proteica de marcadores mesenquimales, incluyendo N-cadherin, Snail y Slug37 (Figura 5B). Por el contrario, E-cadherin, un marcador epitelial, fue regulado en células NMuMG después de 2 días de tratamiento TGF-β (Figura 5B). Además, realizamos reacciones cuantitativas en cadena de polimerasa en tiempo real (qRT-PCR) para investigar la expresión génica de los marcadores EMT. CDH1 (codificación de la proteína E-cadherin) se redujo significativamente, mientras que los marcadores mesenquimales como SNAIL y Zinc finger E-box-binding homeobox 2 (ZEB2) se incrementaron notablemente después de la estimulación de TGF-β en células NMuMG en comparación con las células no tratadas (Figura 5C). TGF-β-inducido EMT en células NMuMG se confirmó aún más por la tinción de inmunofluorescencia de E-cadherin. Tras la estimulación de TGF-β durante 2 días, las células NMuMG expresaron menos E-cadherin que las células del grupo de control no inducido, analizado por microscopía confocal(Figura 5D). Además, las células NMuMG en presencia de TGF-β formaron más fibras de tensión actina, como se muestra en la microscopía confocal (Figura 5E).
SB431542 y GW788388 inhiben la señalización TGF-β y la EMT inducida por TGF-β SB431542 es un inhibidor competitivo de ATP del dominio quinasa de TβRI, también denominado activin receptor-como quinasa 5 (ALK5), mientras que GW788388 inhibe la actividad de TβRI y TβRII quinasa. Ambos inhibidores pueden inhibir la señalización del receptor TGF-β40. Por lo tanto, tratamos células NMuMG con diferentes concentraciones de GW788388 en presencia de TGF-β durante 1 hora. Como era de esperar, GW788388 inhibió la fosforilación SMAD2 inducida por TGF-β de una manera dependiente de la dosis (Figura 6A). Además, el tratamiento SB431542(Figura 6A)bloqueó la fosforilación mediada por TGF-β de SMAD2. El SMAD2/3 fosforilado forma un complejo heteromérico con SMAD4 y se transloca en el núcleo para modular la transcripción de genes objetivo. Por lo tanto, investigamos la translocación de SMAD2/3 en células NMuMG por tinción de inmunofluorescencia de SMAD2/3. Los datos demostraron que tanto SB431542 como GW788388 inhibieron significativamente la translocación nuclear inducida por TGF-β y la acumulación de SMAD2/3 en células NMuMG (Figura 6B). Además, los efectos inhibitorios de SB431542 y GW788388 también se observaron en los niveles de expresión de ARNM de genes diana importantes β TGF implicados en emt, incluidos PAI-1, SNAIL, E-cadherin y fibronectina (Figura 6C). Estos datos sugirieron que SB431542 y GW788388 bloquearon la señalización TGF-β y la EMT inducida por TGF-β.
Análisis de la transdiferenciación de las células mesenquimales del cáncer de mama en adipocitos Emt desempeña un papel vital en la mejora de la plasticidad celular en los cánceres y resulta en el desarrollo de la resistencia a la terapia. La plasticidad de las células cancerosas puede dirigirse e inhibirse directamente con un enfoque de diferenciación trans, como la adipogénesis forzada30. Utilizamos células de cáncer de mama murina Py2T, que se derivaron de la glándula mamaria de un ratón mammary tumor-polioma tumor-antígeno medio (MMTV-PyMT) ratón transgénico, como un modelo celular de plasticidad de células cancerosas inducida por EMT. Sobre la base de un protocolo establecido41,tratamos células de cáncer de mama de py2T murcianas derivadas de EMT con el fármaco antidiabético rosiglitazona durante 10 días para inducir la adipogenesis. La adipogenesis se evaluó visualizando gotas lipídicas utilizando manchas de O de color rojo aceite. Las células grasas se detectaron fácilmente en células de cáncer de mama de py2T murcianas tratadas con rosiglitazona(Figura 7),que demostraron que el tratamiento solo con rosiglitazona es suficiente para promover la transdiferenciación de las células de cáncer de mama derivadas de la EMT en adipocitos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig01.jpg"> Figura 1: Señalización TGF-β/SMAD. La señalización TGF-β inicia con la unión de TGF-β al receptor TGF-β tipo II (TβRII), una quinasa constitutivamente activa, que fosforila el receptor TGF-β tipo I (TβRI). A continuación, el fosforilatos de quinasa TβRI activados SMAD2/3. Se utilizó un péptido que contenía el motivo SSXS de SMAD2 con dos residuos de serina fosforilada terminal carboxígena para obtener antisera policlonal reconociendo fósforo-SMAD2 (p-SMAD2). Por lo tanto, el análisis de la expresión p-SMAD2 por hinchazón occidental se puede utilizar para determinar la activación de la vía de señalización TGF-β. El SMAD2/3 fosforilado puede formar complejos heteroméricos con SMAD4, que luego se translocan en el núcleo para modular las respuestas transcripcionales. El ensayo del reportero12-luciferasa y el PCR cuantitativo en tiempo real (qRT-PCR) para la expresión de ARNM de genes objetivo β TGF como SMAD7 y SERPINE1 (proteína PAI-1 codificación), se pueden utilizar para analizar respuestas transcripcionales dependientes del SMAD3 inducidas por TGF-β. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig02.jpg"> Figura 2: Estructura esquemática de R-SMADs (SMAD2 y SMAD3). Los dominios MH1 (azul) y MH2 (amarillo) se conservan entre R-SMADs, pero la región del vinculador (gris) no se conserva. El dominio MH1 de SMAD3 alberga un motivo de unión al ADN, mientras que SMAD2 no puede unir directamente el ADN, debido a una inserción (exon 3) en su dominio MH1. El dominio MH2 media la oligomerización SMAD, la interacción con los receptores TGF-β y la unión a proteínas y participa en la regulación transcripcional. SMAD2 y SMAD3 se pueden activar mediante la fosforilación del motivo SSXS (en rojo) en su C termini. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig03.jpg"> Figura 3: TGF-β-inducido EMT. Durante la transición epitelial-mesenquimal inducida por TGF-β (EMT), las células sufren pérdida de epitelial y adquisición de características mesenquimales con mayor motilidad celular y capacidad de invasión. La inducción de emt conduce a la expresión de marcadores mesenquimales como N-cadherin, Zeb2, y Snail1/2, así como la regulación descendente de marcadores epiteliales incluyendo E-cadherin, β-catenina, y claudin-1. La pérdida o ganancia acumulada de características epiteliales/mesenquimales (E/M) hace que una célula entre en estados intermedios de manera reversible. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig04.jpg"> Figura 4: TGF-β las respuestas de señalización en las células MCF10A-Ras. (A) Las células MCF10A-Ras fueron tratadas con o sin TGF-β (2.5 ng/mL) durante 1 hora, y los liatos celulares fueron inmunoblotted para SMAD2 fosforilado (p-SMAD2), SMAD2/3 total y GAPDH (como control de carga). El marcador de tamaño se muestra a la derecha. Contra: Grupo de control sin tratamiento TGF-β. B) Análisis de la actividad de TGF-β (5 ng/mL) utilizando el reportero transcripcional12-luciferasa (LUC) dependiente de SMAD3-SMAD4 en células MCF10A-Ras. Los valores se normalizan a β-galactosidasa (βGal). Los datos se expresan como la media ± s.d, n = 3. Prueba de t del estudiante, ***P ≤ 0.001 (C) análisis qRT-PCR de los genes diana TGF-β SMAD7 y SERPINE1 (codificación de la proteína PAI-1) en células MCF10A-Ras tratadas con TGF-β (2,5 ng/mL) durante 6 horas. GAPDH se utilizó como control interno. Los datos se expresan como la media ± s.d, n = 3. Prueba del estudiante, ***P ≤ 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig05.jpg"> Figura 5: TGF-β-inducido EMT en células NMuMG. (A) Morfología de células NMuMG tratadas con TGF-β (2,5 ng/mL) durante 1 o 2 días. En presencia de TGF-β, células NMuMG transdiferenciadas en un fenotipo mesenquimal. Barra de escala = 150 células NMuMG de μm (B) fueron tratadas con o sin TGF-β (5 ng/mL) durante 2 días, y los marcadores EMT fueron analizados por la hinchazón occidental. El marcador de tamaño es como se indica a la derecha. Contra: Grupo de control sin tratamiento TGF-β. (C) Análisis de expresión génica de marcadores EMT(CDH1 (codificación de la proteína E-cadherin), SNAIL y ZEB2) en células NMuMG tratadas durante 2 días con TGF-β (5 ng/mL). GAPDH se utilizó como control interno. Los resultados se expresan como la media ± s.d., n = 3. Prueba t del estudiante, *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001. (D) Las células NMuMG fueron manchadas por inmunofluorescencia para detectar la expresión del marcador epitelial E-cadherin (rojo) después del tratamiento TGF-β (2.5 ng/mL) durante 2 días. Los nuclei fueron contradelados con DAPI (azul). Las imágenes fueron capturadas con microscopía confocal. Barra de escala = 50 μm (E) Células NMuMG fueron manchadas con fluoresceína-faloides (verde) para visualizar F-actin. Los nuclei fueron contradelados con DAPI (azul). Barra de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig06.jpg"> Figura 6: TGF-βsignaling y TGF-β-induced EMT fueron inhibidos por SB431542 y GW788388. (A) Las células NMuMG fueron tratadas con 10 μM de SB431542 (SB) o las concentraciones indicadas de GW788388 (GW) en presencia o ausencia de TGF-β (5 ng/mL) durante 1 hora. Los lysatos celulares fueron inmunoblotted para p-SMAD2, SMAD2/3 y GAPDH. (B) Las células NMuMG fueron tratadas con 5 μM de SB431542 (SB) o 10 μM de GW788388 (GW) en presencia o ausencia de 5 ng/mL de TGF-β durante 1 hora y manchadas por inmunofluorescencia para detectar la translocación nuclear de SMAD2/3 (verde). Las imágenes fueron capturadas con microscopía confocal. (C) La expresión de genes objetivo β TGF, incluyendo PAI-1 y genes que codifican marcadores EMT, incluyendo SNAIL, E-Cadherin y Fibronectin, fueron analizados por reacción inversa en cadena de la polimerasa transcriptasa (RT-PCR) en células NMuMG después del tratamiento SB o GW y estimulación de TGF-β durante 48 horas. GAPDH sirvió como control de carga. Control denota celdas no tratadas. Esta cifra ha sido modificada de Petersen M. et al. 34 con permiso del editor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig07.jpg"> Figura 7: Las células de cáncer de mama de py2T murcianas derivadas de emt pueden ser inducidas a diferenciarse en adipocitos. Las células de cáncer de mama de py2T murine fueron estimuladas con 2 ng/mL TGF-β durante 20 días para inducir la EMT completa. Luego, las células fueron tratadas con DMSO como control del vehículo o rosiglitazona (2 μM) durante 10 días para permitir la diferenciación de las células cancerosas mesenquimales e inducir adipogénesis. El medio se cambiaba cada 2 días. Después de 10 días de tratamiento, las células fueron manchadas con aceite rojo O. Barra de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig07large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>especie</td>
			<td>Nombre genético</td>
			<td colspan="2">Delantero (5' a 3')</td>
			<td colspan="2">Reverso (5' a 3')</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Humano</td>
			<td>GAPDH</td>
			<td colspan="2">TGCACCACCAACTGCTTAGC</td>
			<td colspan="2">GGCATGGACTGTGGTCATGAG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SMAD7</td>
			<td colspan="2">TCCAGATGCTGTGCCTTCC</td>
			<td colspan="2">GTCCGAATTGAGCTGTCCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SERPINE1</td>
			<td colspan="2">CACAAATCAGACGGCAGCACT</td>
			<td colspan="2">CATCGGGCGTGGTGAACTC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">ratón</td>
			<td>GAPDH</td>
			<td colspan="2">TGGCAAAGTGGAGATTGTTGCC</td>
			<td colspan="2">AAGATGGTGATGGGCTTCCCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>CDH1</td>
			<td colspan="2">ACCAAAGTGACGCTGAAGTC</td>
			<td colspan="2">GAGGATGTACTTGGCAATGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>caracol</td>
			<td colspan="2">CAGCTGGCCAGGCTCTCGGT</td>
			<td colspan="2">GCGAGGGCCTCCGGAGCA</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZEB2</td>
			<td colspan="2">TTCTGCAAGCCTCTGTAGCC</td>
			<td colspan="2">TTCTGGCCCCATTGCATCAT</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Imprimaciones utilizadas para qRT-PCR.

Watch this Scientific Journal Video about Studying TGF-ÃŽÂ² Signaling and TGF-ÃŽÂ²-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells at JoVE.com

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Describimos un flujo de trabajo sistemático para investigar la señalización β TGF y la EMT inducida por TGF-β mediante el estudio de la proteína y la expresión génica implicadas en esta vía de señalización. Los métodos incluyen hinchazón occidental, un ensayo de reportero luciferasa, qPCR y tinción de inmunofluorescencia.

Estudio de la señalización β TGF y la transición epitelial a mesenquimal inducida por TGF-β en cáncer de mama y células normales

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...

studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal

Research

JoVE Journal

Cancer Research

12.4K vistas.  Leiden University Medical Center. Describimos un flujo de trabajo sistemático para investigar la señalización β TGF y la EMT inducida por TGF-β mediante el estudio de la proteína y la expresión génica implicadas en esta vía de señalización. Los métodos incluyen hinchazón occidental, un ensayo de reportero luciferasa, qPCR y tinción de inmunofluorescencia.

Video: Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery of the next generation of novel drug targets. It is becoming apparent that more complex models of cancer are required to fully appreciate the contributing factors that drive tumorigenesis in vivo and increase the efficacy of novel therapies that make the transition from pre-clinical models to clinical trials.
Here we present a methodology for generating uniform and reproducible tumor spheroids that can be subjected to siRNA functional screening. These spheroids display many characteristics that are found in solid tumors that are not present in traditional two-dimension culture. We show that several commonly used breast cancer cell lines are amenable to this protocol. Furthermore, we provide proof-of-principle data utilizing the breast cancer cell line BT474, confirming their dependency on amplification of the epidermal growth factor receptor HER2 and mutation of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) when grown as tumor spheroids. Finally, we are able to further investigate and confirm the spatial impact of these dependencies using immunohistochemistry.

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

La utilización de la genómica funcional de selección para identificar dianas farmacológicas potencialmente nueva en la celda cáncer culturas Esferoide

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Synthesis and Characterization of an Aspirin-fumarate Prodrug that Inhibits NF&#954;B Activity and Breast Cancer Stem Cells

Inflammation is a cancer hallmark that underlies cancer incidence and promotion, and eventually progression to metastasis. Therefore, adding an anti-inflammatory drug to standard cancer regiments may improve patient outcome. One such drug, aspirin (acetylsalicylic acid, ASA), has been explored for cancer chemoprevention and anti-tumor activity. Besides inhibiting the cyclooxygenase 2-prostaglandin axis, ASA&#39;s anti-cancer activities have also been attributed to nuclear factor &#312;B (NF&#312;B) inhibition. Because prolonged ASA use may cause gastrointestinal toxicity, a prodrug strategy has been implemented successfully. In this prodrug design the carboxylic acid of ASA is masked and additional pharmacophores are incorporated.
This protocol describes how we synthesized an aspirin-fumarate prodrug, GTCpFE, and characterized its inhibition of the NF&#312;B pathway in breast cancer cells and attenuation of the cancer stem-like properties, an important NF&#312;B-dependent phenotype. GTCpFE effectively inhibits the NF&#312;B pathway in breast cancer cell lines whereas ASA lacks any inhibitory activity, indicating that adding fumarate to ASA structure significantly contributes to its activity. In addition, GTCpFE shows significant anti-cancer stem cell activity by blocking mammosphere formation and attenuating the cancer stem cell associated CD44+CD24- immunophenotype. These results establish a viable strategy to develop improved anti-inflammatory drugs for chemoprevention and cancer therapy.

Synthesis and Characterization of an Aspirin-fumarate Prodrug that Inhibits NF&amp;#954;B Activity and Breast Cancer Stem Cells

This procedure will demonstrate how we synthesized and characterized the anti-NF&#954;B and anti-cancer stem cell activity of an aspirin-fumarate prodrug.

Síntesis y caracterización de un profármaco Aspirina-fumarato que inhibe la actividad de NFkB y de la mama células madre del cáncer

Inflammation is a cancer hallmark that underlies cancer incidence and promotion, and eventually progression to metastasis. Therefore, adding an ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying cancer metastasis in vivo, other efficient, reliable, low-cost models are needed to quickly access the potential effects of (epi)genetic changes or pharmacological compounds. As such, we illustrate and explain the feasibility of xenograft models using human breast cancer cells injected into zebrafish embryos to support this goal. Under the microscope, fluorescent proteins or chemically labeled human breast cancer cells are transplanted into transgenic zebrafish embryos, Tg (fli:EGFP), at the perivitelline space or duct of Cuvier (Doc) 48 h after fertilization. Shortly afterwards, the temporal-spatial process of cancer cell invasion, dissemination, and metastasis in the living fish body is visualized under a fluorescent microscope. The models using different injection sites, i.e., perivitelline space or Doc are complementary to one another, reflecting the early stage (intravasation step) and late stage (extravasation step) of the multistep metastatic cascade of events. Moreover, peritumoral and intratumoral angiogenesis can be observed with the injection into the perivitelline space. The entire experimental period is no more than 8 days. These two models combine cell labeling, micro-transplantation, and fluorescence imaging techniques, enabling the rapid evaluation of cancer metastasis in response to genetic and pharmacological manipulations.

Here, we describe xenograft zebrafish models using two different injection sites, i.e., perivitelline space and duct of Cuvier, to investigate the invasive behavior and to assess the intravasation and extravasation potential of human breast cancer cells, respectively.

El comportamiento invasivo de las células del cáncer de mama humano en embriones de pez cebra

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In particular, endothelial cells (EC) constituting the inner surface of vessels, directly participate in oxygen delivery, nutrient supply, and removal of waste products to and from tumors, and are thereby prominently involved in the constitution of the tumor microenvironment (TME). Tumor endothelial cells (TECs) can be used as cellular biosensors of the intratumoral microenvironment established by communication between tumor and stromal cells. TECs also serve as targets of therapy. Accordingly, in culture these cells allow studies on mechanisms of response or resistance to anti-angiogenic treatment. Recently, it was found that TECs isolated from human colorectal carcinoma (CRC) exhibit memory-like effects based on the specific TME they were derived from. Moreover, these TECs actively contribute to the establishment of a specific TME by the secretion of different factors. For example, TECs in a prognostically favorable Th1-TME secrete the anti-angiogenic tumor-suppressive factor secreted protein, acidic and rich in cysteine-like 1 (SPARCL1). SPARCL1 regulates vessel homeostasis and inhibits tumor cell proliferation and migration. Hence, cultures of pure, viable TECs isolated from human solid tumors are a valuable tool for functional studies on the role of the vascular system in tumorigenesis. Here, a new up-to-date protocol for the isolation of primary EC from the normal colon as well as CRC is described. The technique is based on mechanical and enzymatic tissue digestion, immunolabeling, and fluorescence activated cell sorting (FACS)-sorting of triple-positive cells (CD31, VE-cadherin, CD105). With this protocol, viable TEC or normal endothelial cell (NEC) cultures could be isolated from colon tissues with a success rate of 62.12% when subjected to FACS-sorting (41 pure EC cultures from 66 tissue samples). Accordingly, this protocol provides a robust approach to isolate human EC cultures from normal colon and CRC.

Tumor endothelial cells are important determinants of the tumor microenvironment and the course of the disease. Here, a protocol for the isolation of pure and viable endothelial cells from human colorectal carcinoma and normal colon to be used in drug testing and pathogenesis research is described.

Aislamiento de células endoteliales humanas de Colon Normal y el Carcinoma colorrectal - un protocolo mejorado

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue and its role in local recurrence at the primary tumor site are unknown. Here we present a method for the decellularization, lyophilization, and fabrication of ECM hydrogels derived from murine mammary fat pads. Results are presented on the effectiveness of the decellularization process, and rheological parameters were assessed. GFP- and luciferase-labeled breast cancer cells encapsulated in the hydrogels demonstrated an increase in proliferation in irradiated hydrogels. Finally, phalloidin conjugate staining was employed to visualize cytoskeleton organization of encapsulated tumor cells. Our goal is to present a method for fabricating hydrogels for in vitro study that mimic the in vivo breast tissue environment and its response to radiation in order to study tumor cell behavior.

This protocol presents a method for decellularization and subsequent hydrogel formation of murine mammary fat pads following ex vivo irradiation.

Estudio de los efectos de radiación de tejido normal con hidrogeles de matriz extracelular

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and recurrent disease. This population can be identified by surface markers, enzymatic activity and a functional profile. These approaches per se are limited, due to phenotypic heterogeneity and CSC plasticity. Here, we update the sphere-forming protocol to obtain CSC spheres from breast and gynecological cancers, assessing functional properties, CSC markers and protein expression. The spheres are obtained with single-cell seeding at low density in suspension culture, using a semi-solid methylcellulose medium to avoid migration and aggregates. This profitable protocol can be used in cancer cell lines but also in primary tumors. The tridimensional non-adherent suspension culture thought to mimic the tumor microenvironment, particularly the CSC-niche, is supplemented with epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor to ensure CSC signaling. Aiming for robust identification of CSC, we propose a complementary approach, combining functional and phenotypic evaluation. Sphere-forming capacity, self-renewal and sphere projection area establish CSC functional properties. Additionally, characterization comprises flow cytometry evaluation of the markers, represented by CD44+/CD24- and CD133, and Western blot, considering ALDH. The presented protocol was also optimized for primary tumor samples, following a sample digestion procedure, useful for translational research.

The aim of this methodology is to identify cancer stem cells (CSC) in cancer cell lines and primary human tumor samples with the sphere-forming protocol, in a robust manner, using functional assays and phenotypic characterization with flow cytometry and Western blot.

Obtención de esferas de células madre de cáncer de cáncer de tumores ginecológicos y de cáncer de mama

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction of differentiation of two mouse breast epithelial cell lines, HC11 and EpH4, and their use to study complementary stages of mammary gland development and neoplastic transformation.
The HC11 mouse breast epithelial cell line originated from the mammary gland of a pregnant Balb/c mouse. It differentiates when grown to confluence attached to a plastic Petri dish surface in medium containing fetal calf serum and Hydrocortisone, Insulin and Prolactin (HIP medium). Under these conditions, HC11 cells produce the milk proteins &#946;-casein and whey acidic protein (WAP), similar to lactating mammary epithelial cells, and form rudimentary mammary gland-like structures termed &#34;domes&#34;.
The EpH4 cell line was derived from spontaneously immortalized mouse mammary gland epithelial cells isolated from a pregnant Balb/c mouse. Unlike HC11, EpH4 cells can fully differentiate into spheroids (also called mammospheres) when cultured under three-dimensional (3D) growth conditions in HIP medium. Cells are trypsinized, suspended in a 20% matrix consisting of a mixture of extracellular matrix proteins produced by Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma cells, plated on top of a layer of concentrated matrix coating a plastic Petri dish or multiwell plate, and covered with a layer of 10% matrix-containing HIP medium. Under these conditions, EpH4 cells form hollow spheroids that exhibit apical-basal polarity, a hollow lumen, and produce &#946;-casein and WAP.
Using these techniques, our results demonstrated that the intensity of the cadherin/Rac signal is critical for the differentiation of HC11 cells. While Rac1 is necessary for differentiation and low levels of activated RacV12 increase differentiation, high RacV12 levels block differentiation while inducing neoplasia. In contrast, EpH4 cells represent an earlier stage in mammary epithelial differentiation, which is inhibited by even low levels of RacV12.

We describe techniques for differentiation induction of two breast epithelial lines, HC11 and EpH4. While both require fetal calf serum, insulin, and prolactin to produce milk proteins, EpH4 cells can fully differentiate into mammospheres in three-dimensional culture. These complementary models are useful for signal transduction studies of differentiation and neoplasia.

Diferenciación de células epiteliales de mama de ratón HC11 y EpH4

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less aggressive breast tumors, the 5-year survival rate of TNBC patients is 77% due to their characteristic drug-resistant phenotype and metastatic burden. Toward this end, murine models have been established aimed at identifying novel therapeutic strategies limiting TNBC tumor growth and metastatic spread. This work describes a practical guide for the TNBC orthotopic model where MDA-MB-231 breast cancer cells suspended in a basement membrane matrix are implanted in the fourth mammary fat pad, which closely mimics the cancer cell behavior in humans. Measurement of tumors by caliper, lung metastasis assessment via in vivo and ex vivo imaging, and molecular detection are discussed. This model provides an excellent platform to study therapeutic efficacy and is especially suitable for the study of the interaction between the primary tumor and distal metastatic sites.

This work presets an advanced protocol to accurately assess tumor loading by detection of green fluorescent protein and bioluminescence signals as well as the integration of quantitative molecular detection technique.

Estudio del triple cáncer de mama negativo con el modelo de cáncer de mama ortotópico

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. Immortalized cell lines are easy to grow and genetically modify to study molecular mechanisms, yet the selective pressure from cell culture often leads to genetic and epigenetic alterations over time. Patient-derived xenograft (PDX) models faithfully recapitulate the heterogeneity and drug response of human breast tumors. PDX models exhibit a relatively short latency after orthotopic transplantation that facilitates the investigation of breast tumor biology and drug response. The transplantable genetically engineered mouse models allow the study of breast tumor immunity. The current protocol describes the method to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad followed by drug treatments. These preclinical models provide valuable approaches to investigate breast tumor biology, drug response, biomarker discovery and mechanisms of drug resistance.

Patient-derived xenograft (PDX) models and transplantable genetically engineered mouse models faithfully recapitulate human disease and are preferred models for basic and translational breast cancer research. Here, a method is described to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad to study tumor biology and evaluate drug response.

Trasplante ortotópico de tumores de mama como modelos preclínicos para el cáncer de mama

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

Aislamiento y evaluación funcional de células madre de cáncer de mama humano a partir de muestras de células y tejidos

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...