Name: studying tgf-β signaling and tgf-β-induced epithelial-to-mesenchymal transition in breast cancer and normal cells
Uploaded: 2020-10-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying TGF-Î² Signaling and TGF-Î²-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells at JoVE.com

Reconocemos el apoyo del Consejo chino de becas (CSC) a J.Z. y al Cancer Genomics Centre Netherlands (CGC. NL) a P.t.D.

1. Análisis de la fosforilación SMAD2 inducida por TGF-β usando hinchazón occidental
NOTA: Las células MCF10A-Ras de mama humana premalignante se utilizaron como ejemplo para investigar las respuestas de señalización TGF-β33. En principio, los métodos descritos a continuación también son aplicables a otras líneas celulares sensibles a TGF-β.
<ol><li>Cultivo de la línea celular epitelial mamaria MCF10A-Ras a 37 °C en el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)/F12 que contiene L-glutamina con 5% suero de caballo, 20 factor de crecimiento epidérmico ng/mL (FEAG), 10 mg/ml de insulina, 100 ng/ml de enterotoxina de cólera, 0,5 mg/ml de hidrocortisona y 1:100 penicilina-estreptomicina (Pen-Strep).</li>
	<li>Pruebe las células MCF10A-Ras con 1 ml de 0.25% trypsin-EDTA durante 1 minuto y cuente células viables usando un contador de células.</li>
	<li>Células de semillas en placas de 6 pozos a una densidad de 5×105 celdas/pozo.</li>
	<li>Después del crecimiento nocturno, trate las células con TGF-β (5 ng/mL) o tampón de ligando (4 mM HCl, 0,1% albúmina sérica bovina libre de ácidos grasos (BSA)) durante 1 hora, y luego elimine el cultivo medio y lave suavemente las células dos veces con 1 ml de solución salina amortiguada por fosfato (PBS).</li>
	<li>Enfriar las células en placas de 6 pozos sobre hielo y añadir 150 μL de ensayo de precipitación inmunitaria por radio preenfriamiento (RIPA) tampón de lisis (150 mM NaCl, 0.1% Tritón X-100, 0.5% desoxicolato de sodio, 0.1% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, y cóctel de inhibidor de mini proteasa recién añadido). Deje que la lisis continúe sobre hielo durante 10 minutos.</li>
	<li>Raspe las células adherentes del plato usando un rascador de células de plástico, luego transfiera suavemente la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga precooled.</li>
	<li>Centrífuga la célula lysate durante 10 minutos a 150 fuerza centrífuga (x g) a 4 °C y transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga fresco de 1,5 ml.</li>
	<li>Mida la concentración de proteínas utilizando un kit de ensayo proteico compatible con detergente (CC).</li>
	<li>Cargue 30 μg de proteína de cada muestra en un gel de electroforesis de policristulación de sulfato de dodecilo sódico al 10% y ejecute el gel a un voltaje de 100 V durante 1,5-2 horas.</li>
	<li>Transfiera las proteínas del gel a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) de 45-μm a una tensión de 110 V durante 1-1,5 horas.</li>
	<li>Transfiera la membrana PVDF a un recipiente adecuado con el lado proteico (el lado que estaba mirando hacia arriba del gel) hacia arriba, y enjuague brevemente la membrana en agua destilada.</li>
	<li>Deseche el agua, agregue la solución Ponceau S y coloque la membrana en una plataforma de balanceo durante 1-2 minutos.</li>
	<li>Despresta la membrana con agua destilada enjuagando rápidamente y luego lavándola durante 1 minuto.</li>
	<li>A continuación, coloque la membrana PVDF en una caja de luz y tome una foto para comprobar si hay cargas totales de proteínas iguales.</li>
	<li>Lave la membrana con solución salina tamponada tris con Tween 20 (TBST, Tris-HCl de 20 mM, pH 7,4, NaCl de 150 mM y 0,1% Tween 20) hasta que no haya manchas visibles.</li>
	<li>Ponga la membrana en amortiguador de bloqueo (5% de leche descremada en solución TBST) e incubarla durante 1 hora a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave la membrana dos veces con TBST.</li>
	<li>Incubar la membrana con anticuerpos primarios contra fosfo-SMAD2 (p-SMAD2; 1:1000, hecho en casa 34),SMAD2/3 total 1:1000 y gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH; 1:1000), durante la noche a 4 °C.</li>
	<li>Lave la membrana dos veces con TBST e incubar la membrana con un anticuerpo secundario contra conejo o ratón (1:5000) durante 2 horas.</li>
	<li>Incubar la membrana PVDF con sustrato ECL occidental durante 30 segundos y detectar la señal utilizando un sistema de imágenes.</li>
	<li>Repita los experimentos al menos tres veces para obtener triplicatos biológicos.</li>
</ol>2. Análisis de las respuestas transcripcionales inducidas por TGF-β dependientes de SMAD3
<ol><li>Realice el ensayo de reportero transcripcional SMAD3/SMAD4 dependiente de12-luciferase.<ol>
<li>Cultivo y trypsinize células MCF10A-Ras como se describe en el paso 1. Sembrar células en placas de 24 pozos a 5×104 células/pozo y permitir que las células se adhieran durante la noche.</li>
		<li>Al día siguiente de la siembra, cotransfectar las células en cada pozo con 100 ng del TGF-β/SMAD3-inducible (CAGA)12 luciferasa transcriptional reportero construido35 y 80 ng de la β-galactosidasa expresión construcción utilizando polietilenimina (PEI). La transfección de β-galactosidasa se utiliza para normalizar las diferencias en la eficiencia de la transfección entre diferentes pozos. Configure todos los grupos experimentales en triplicado.</li>
		<li>Después de 24 horas de incubación, las células de hambre con glucosa dmem-alta sin suero y, 6 horas más tarde, añadir TGF-β (5 ng / mL) o tampón de ligando (4 mM HCl, 0.1% BSA) como un control del vehículo a las células.</li>
		<li>Después de otras 24 horas de incubación, lave las células dos veces con PBS preguerra.</li>
		<li>Añadir 120 μL/pozo 1× tampón de lisis y agitar suavemente la placa a 4 °C durante 20 minutos.</li>
		<li>Transfiera 30 μL de lisato a cada pozo de una microplaca de ensayo blanco de 96 pozos para medir la actividad luciferasa utilizando un luminosómetro.</li>
		<li>Transfiera 50 μL de lisato a cada pozo de una placa transparente de 96 pozos para medir la actividad β-galactosidasa.</li>
		<li>Normalizar la actividad luciferasa a la actividad β-galactosidasa y repetir los experimentos al menos tres veces para obtener triplicatos biológicos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analizar la expresión de los genes objetivo β TGF utilizando la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real (qRT-PCR).<ol>
<li>Cultivo y trypsinize células MCF10A-Ras como se describe en el paso 1. Sembrar células en placas de 6 pozos a 5×105 células/pozo y permitir que las células se adhieran durante la noche.</li>
		<li>Tratar las células con TGF-β (5 ng/mL) o búfer de ligando (4 mM HCl, 0.1% BSA) durante 6 horas, y luego lavar las células dos veces con 1 mL de PBS.</li>
		<li>Aísle el ARN total mediante un kit de aislamiento de ARN.</li>
		<li>Determine la concentración de ARN con un NanoDrop y realice la síntesis de cDNA con 1 μg de ARN utilizando un kit de síntesis cDNA de primera hebra.</li>
		<li>Utilice un sistema de detección de PCR en tiempo real para realizar PCR cuantitativo en tiempo real (qRT-PCR) con cDNA diluido diez veces en una mezcla de reacción de 10 μL que incluye imprimaciones específicas para el avance humano y el reverso para GAPDH (para la normalización), SERPINE1 (codificación de la proteína PAI-1, un gen objetivo TGF-β/SMAD), SMAD7 (gen objetivo TGF-β/SMAD) y qPCR Master Mix. Configure todos los grupos experimentales en triplicado. NOTA: Las secuencias de imprimación utilizadas para detectar genes humanos objetivo en qRT-PCR se enumeran en la Tabla 1.</li>
		<li>Utilice las siguientes condiciones de reacción qPCR: inicialización, 95 °C durante 3 minutos; desnaturalización, 95 °C durante 10 segundos; recocido, 60 °C durante 30 segundos; y extensión, 80 °C durante 10 segundos; desnaturalización, recocido y extensión se repiten 40 veces.</li>
		<li>Repita los experimentos al menos tres veces para obtener triplicatos biológicos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Análisis de TGF-β inducido EMT
<ol><li>Analice la expresión de los marcadores EMT a nivel proteico utilizando la hinchazón occidental. NOTA: El análisis de TGF-β-induced EMT se muestra utilizando células epiteliales NMuMG del ratón como ejemplo36,37.<ol>
<li>Cultivo NMuMG células a 37 °C en dmem-alto medio de glucosa complementado con 10% suero bovino fetal y 1:100 Pen-Strep. Utilice los métodos descritos en el paso 1 para el aislamiento y la detección de proteínas. NOTA: En este experimento se utilizan los siguientes anticuerpos: E-cadherin, 1:1000; N-cadherin, 1:1000; Caracol, 1:1000; , 1:1000; Tubulina, 1:1000 (Figura 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analice la expresión de los marcadores EMT en el nivel de ARNM utilizando el PCR cuantitativo en tiempo real como se describe en el paso 2.2. NOTA: Todas las imprimaciones del ratón utilizadas para qRT-PCR, incluido CDH1 (codificación de la proteína E-cadherin), SNAILy ZEB2 (Figura 3) se enumeran en la Tabla 1.</li>
	<li>Analice el proceso emt utilizando inmunofluorescencia indirecta y tinción directa de fluorescencia.<ol>
<li>Tinción indirecta de inmunofluorescencia de E-cadherin<ol>
<li>Coloque cubiertas de vidrio cuadrados estériles de 18 mm en placas de 6 pozos (una cubierta por pozo).</li>
			<li>Semilla 1×105 células NMuMG con 2 ml de DMEM completo por placa de 6 pozos y permitir que las células se adhieran durante la noche.</li>
			<li>Mueva suavemente las cubiertas con células adherentes a una nueva placa de 6 pozos y agregue 2 ml de medio de cultivo a los pozos.</li>
			<li>Tratar las células con TGF-β (5 ng/mL) o búfer de ligando (4 mM HCl, 0.1% BSA) durante 2 días.</li>
			<li>Retire el medio de cultivo y lave suavemente las células dos veces con 1 ml de PBS pre-warmed.</li>
			<li>Corrija las células añadiendo 1 ml de paraformaldehído e incubando durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, lave suavemente las células dos veces con 1 ml de PBS.</li>
			<li>Permeabilizar las células fijas con 0.1% Tritón X-100 durante 10 minutos a temperatura ambiente y lavar las células dos veces con PBS.</li>
			<li>Bloquee las células con 5% BSA en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente y lave las células dos veces con PBS.</li>
			<li>Agregue el anticuerpo primario contra E-cadherin (diluido 1:1000 en PBS) a la parte superior de cada tapadera e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente.</li>
			<li>Retire el anticuerpo primario y lave el tapatío con PBS tres veces.</li>
			<li>Agregue el anticuerpo secundario Alexa Fluor 555 (diluido 1:500 en PBS) a la parte superior de cada coverlip e incuba durante 1 hora a temperatura ambiente mientras cubre con papel de aluminio para protegerse de la luz.</li>
			<li>Retire el anticuerpo secundario y lave el tapatío con PBS tres veces.</li>
			<li>Monte el tubo de cubierta (celdas mirando hacia abajo) sobre toboganes de vidrio utilizando el medio de montaje con 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) y guarde las diapositivas montadas en una caja a 4 °C, protegidas de la luz.</li>
			<li>Observe la tinción con microscopía confocal SP8.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Tinción directa de fluorescencia de filamentos (F)-actina.<ol>
<li>Prepare muestras siguiendo los pasos 3.3.1.1. a 3.3.1.9.</li>
			<li>Mancha las células añadiendo Alexa Fluor 488 Phalloidin (1:1000) durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad para visualizar actina filamentosa (F-actin).</li>
			<li>Lave las células tres veces con PBS.</li>
			<li>Monte el tubo de cubierta en diapositivas de vidrio utilizando el medio de montaje con DAPI y tome imágenes con microscopía confocal SP8.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La señalización TGF-β/SMAD desempeña un papel fundamental en la progresión del cáncer de mama, ya que puede promover la invasión y metástasis de las células del cáncer de mama induciendo emt7. Aquí, describimos un flujo de trabajo lógico para investigar la señalización iniciada por TGF-β desde la activación SMAD inducida por receptores hasta las respuestas transcripcionales y biológicas mediadas por SMAD. Comenzamos describiendo el análisis de la fosforilación SMAD2, continuamos con respuestas transcripcionales inducidas por TGF-β dependientes de SMAD3 y expresión de marcador EMT tanto a nivel genético como proteico para analizar la respuesta de señalización TGF-β/SMAD, y finalmente examinamos la EMT inducida por TGF-β. Utilizamos el reportero transcripcional12-luciferase que contiene cajas derivadas del promotor PAI-1, para monitorear la actividad de la ruta de señalización TGF-β/SMAD35. Esta construcción de reportero requiere SMAD3 y SMAD4 para su activación. Estudios anteriores han demostrado que el derribo de SMAD4 atenuado TGF-β-inducido12-luciferasa actividad37. Además del ensayo del reportero, determinar el estado de fosforilación de los SMAD endógenos, incluidos SMAD2 y SMAD3, es otra forma de investigar la respuesta de señalización TGF-β. De hecho, otros miembros de la familia TGF-β, como el factor de crecimiento y diferenciación (GDF)-8/miostatina y GDF-9, también transducen señales a través de proteínas SMAD2/3 mediante la participación de TβRI42,43,44. Además del reporterode 12-luciferase, varios reporteros similares han sido utilizados para detectar la activación de la señalización TGF-β. Por ejemplo, un reportero transcripcional (SBE)4-Lux con elementos de respuesta derivados del promotor JunB puede ser inducido eficientemente por TGF-β, activins y BMPs45.
El blotting occidental y el qPCR se utilizaron para analizar la EMT inducida por TGF-β, que son métodos clásicos para investigar la expresión de marcadores epiteliales (es decir, E-cadherin) y marcadores mesenquimales (es decir, N-cadherin, Snail, Slug y Zeb2). También realizamos tinción indirecta de inmunofluorescencia de E-cadherin y tinción directa de fluorescencia de F-actin. Estos ensayos validaron aún más el fenotipo mesenquimal de las células después del tratamiento β TGF. La limitación de la tinción de inmunofluorescencia es que las células necesitan ser fijadas antes de la incubación con anticuerpos e imágenes, y es difícil investigar los cambios en la expresión del marcador EMT en las células vivas. Recientemente, el diseño de líneas celulares reporteras emt, como A549 pulmón adenocarcinoma-vimentina-RFP, ha hecho posible monitorear la transformación de células epiteliales a células mesenquimales en tiempo real a través de la expresión de proteína fluorescente roja (RFP) etiquetada vimentina. Esta plataforma podría ser utilizada para la detección de drogas y el desarrollo de nuevos fármacos46. LifeAct dye, un péptido de 17 aminoácidos, que puede manchar las estructuras de F-actin en las células vivas, se está convirtiendo en una valiosa herramienta para visualizar el citoesqueleto actin en tiempo real sin interferir con los procesos celulares47. En este estudio, utilizamos dos inhibidores de moléculas pequeñas, SB431542 y GW788388, para validar su efecto inhibitorio en la señalización β TGF y la EMT inducida por TGF-β. En particular, GW788388 inhibe poderosamente la actividad TβRI y TβRII, mientras que SB431542 tiene un efecto inhibitorio sólo en TβRI (y ALK4 y ALK7). Estudios anteriores revelaron que GW788388 es más potente in vivo que SB43154240. Además de la inhibición de emt, GW788388 redujo la expresión de marcadores de fibrosis en el riñón, y la administración oral de GW788388 en ratones diabéticos disminuyó notablemente la glomerulopatía25,48.
Emt desempeña un papel esencial en la promoción de la plasticidad de las células cancerosas y resulta en resistencia a los medicamentos y metástasis 49. Por lo tanto, se ha propuesto dirigirse a células derivadas de EMT con fármacos citotóxicos específicos50 o inducir la redifferentiation a través de la transición mesenquimal a epitelial (MET)51 como un enfoque para superar la metástasis de las células cancerosas y la resistencia a la terapia. Sin embargo, el MET contribuye a la proliferación de células cancerosas diseminadas en órganos distantes52,lo que podría ser contraproducente cuando se utiliza la reversión terapéutica de la EMT. Recientemente, un nuevo estudio informó de un enfoque de transdiferenciación terapéutica al dirigirse directamente a las células de cáncer de mama derivadas de EMT para la diferenciación en adipocitos30. El estudio de Ishay-Ronen et. 30 células de cáncer epitelial de murina Py2T utilizadas que habían sido sometidas a una transición a células mesenquimales en respuesta al tratamiento a largo plazo con TGF-β. Demostraron que la rosiglitazona en combinación con inhibidores de MEK mejoró la diferenciación epitelial y la adipogénesis. Sin embargo, encontramos que la rosiglitazona por sí sola era suficiente para inducir la transdiferenciación de células murinas py2T mesenquimales en adipocitos.
En resumen, los métodos utilizados en este estudio proporcionaron un flujo de trabajo lógico para investigar la señalización β TGF y la EMT inducida por TGF-β. Los dos inhibidores, SB431542 y GW788388, pueden bloquear las respuestas inducidas por TGF-β y la EMT. Además, también demostramos rosiglitazona solo induce adipogenesis en ciertas células de cáncer de mama mesenquimal inducida por TGF-β. Aunque utilizamos sólo varias líneas celulares de cáncer de mama para investigar las respuestas β TGF, los métodos descritos aquí podrían extrapolarse a otras células (cáncer). Aquí, utilizamos varias concentraciones de TGF-β para inducir respuestas celulares. En la mayoría de los tipos de células, TGF-β ejerce su actividad biológica en el rango de concentración de 0.01-10 ng/mL53 e induce la señalización en un patrón de dosis-respuesta. En las células endoteliales primarias, incluidas las células endoteliales aórticas bovinas, el TGF-β indujo la expresión sustancial de SMAD2 fosforilado a 0,025 ng/ml, alcanzó un máximo de 0,25 ng/ml, y se mantuvo en este nivel en respuesta a concentraciones más altas53. En nuestro estudio, utilizamos una alta concentración de células TGF-β (5 ng/mL) en MCF10A-Ras para el ensayo de reportero transcripcional para obtener respuestas fuertes. La fosforilación SMAD2 y la expresión génica objetivo pueden ser inducidas por TGF-β a una dosis baja; por lo tanto, utilizamos 2.5 ng / mL TGF-β para tratar las células. Sin embargo, la concentración de trabajo más adecuada depende del tipo de célula y los efectos estimados. Para determinar la mejor concentración de TGF-β, se recomienda tratar las células con diferentes dosis (de baja a alta).

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61830/studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal">Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>.&#160;NMuMG was mislabeled as&#160;cancer cells.
NMuMG cells are non-transformed epithelial breast cells established from a mouse mammary gland. NMuMG cells are frequently used as a model system to investigate TGF-&#946;-induced epithelial to mesenchymal transition (EMT). EMT is induced by TGF-&#946; in premalignant human MCF 10A-RAS (M2) cells and mouse MMTV-PyMT breast cancer cell line. The article has been updated to reflect this.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61830/studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal">Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>.&#160;NMuMG was mislabeled as&#160;cancer cells.

Erratum: Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

El factor de crecimiento transformador de citoquinas β (TGF-β) es el prototipo de un gran grupo de polipéptidos reguladores estructurales y funcionalmente relacionados, incluyendo TGF-βs (es decir, TGF-β1, -β2 y -β3), proteínas morfogénicas óseas (BMPs) y activinas1,2. Todas estas citoquinas desempeñan un papel importante en el desarrollo embrionario y en el mantenimiento de la homeostasis de tejidos y órganos3. La desregulación de TGF-β puede conducir a una gran variedad de enfermedades, incluyendo cáncer4,5. TGF-β desempeña un papel complejo y dual en la progresión del cáncer: en las células epiteliales normales y premalignantes, TGF-β se comporta como supresor de tumores inhibiendo la proliferación e induciendo la apoptosis6,7; sin embargo, en la etapa tardía de progresión tumoral, cuando las respuestas citostáticas están bloqueadas por la activación de oncogenes o la pérdida de genes supresores tumorales, TGF-β actúa como potenciador tumoral promoviendo la transición epitelial a mesenquimal (EMT) en las células cancerosas, permitiendo así la invasión y metástasis de las células cancerosas, actuando sobre las células en el microambiente tumoral, y estimulando la angiogénesis y la evasión inmune8,9,10.
TGF-β se secreta como una molécula precursora inactiva que contiene el terminal carboxímico maduro TGF-β y péptido asociado a la latencia (LAP)11. Este pequeño complejo puede estar covalentemente unido por proteína latente TGF-β-unión (LTBP)12. La liberación de TGF-β madura se puede mediar mediante la acción de proteasas específicas que cortan LAP o por el tirón mecánico de LAP en un proceso dependiente de la integrina13,14. Además de ltbp, Glycoprotein A repeticiones predominantes (GARP) se expresa altamente en la superficie de las células T reguladoras (Tregs) y desempeña un papel similar a LTBP en la regulación de la activación de TGF-β15,16. GARP se une directamente a TGF-β latente a través de la vinculación de disulfuro y la asociación novalente. La activación de TGF-β desde el complejo GARP/TGF-β requiere integrinas17. La β TGF madura se une a los receptores de serina/treonina quinasa β TGF, es decir, TGF-β receptores tipo I (TβRI) y TGF-β tipo II (TβRII)18 para iniciar la señalización. La vinculación de TGF-β a TβRII promueve la contratación de TβRI y la formación de un complejo heteromérico. Posteriormente, TβRI es fosforilado por TβRII quinasa en residuos de serina y trionina en un motivo corto rico en glicina y serina (GS), lo que resulta en su activación19,20. Tras la activación, TβRI activado recluta y fosforila sus sustratos: los dos SMAD específicos del receptor (R-SMADs) que incluyen SMAD2 y SMAD3 (Figura 1). R-SMADs comparten una estructura general similar con dos dominios de homología Mad, MH1 y MH2, que están separados por una región vinculador rica en pro línea (Figura 2). El motivo de unión al ADN dentro del dominio MH1 de SMAD3 no se conserva entre SMAD2 y SMAD3, y SMAD2 no puede enlazar directamente el ADN debido a dos inserciones en su dominio MH1 (exon 3 y L1). SMAD2 y SMAD3 se pueden activar mediante la fosforilación del motivo SSXS en su C-termini (Figura 2). Phosphorylated SMAD2/3 forma complejos heteroméricos con un mediador SMAD común, SMAD4, que se transloca en el núcleo para modular la transcripción de genes objetivo (Figura 1)7,21. Esta vía canónica de señalización SMAD está regulada con precisión y genera respuestas celulares y tisulares específicas como la regulación del destino celular y la metástasis de células tumorales y la invasión22. Además de la señalización TGF-β-SMAD, las vías de señalización no SMAD también pueden ser activadas directamente por los receptores para regular las respuestas celulares posteriores23.
Durante la progresión tumoral, se necesita la activación de vías inducidas por TGF-β dependientes de SMAD e independientes de SMAD para la inducción de EMT. Emt es un proceso reversible en el que las células tumorales se dedifferentian de un fenotipo epitelial, que se asocia con la pérdida de contactos célula-célula y disminución de la polaridad apical-basal, a un fenotipo mesenquimal con mayor motilidad y capacidad de invasión24. Emt se caracteriza por el aumento de la expresión de proteínas marcadoras mesenquimales, incluyendo N-cadherin, vimentina, Zeb2 y Snail1/2, y la regulación descendente concomitante de marcadores epiteliales, tales como E-cadherin y β-catenina (Figura 3)25. Sin embargo, la transición de un epitelial a un estado mesenquimal es a menudo incompleta, y las células obtienen características epiteliales y mesenquimales mixtas (E/M). Un documento reciente de la Asociación Internacional de EMT propuso describir el proceso de las células sometidas a estados fenotípicos E/M intermedios como plasticidad epitelial-mesenquimal (EMP)26. Esta plasticidad se refiere a emt parcial, un estado híbrido E/M, un estado EMT metástasis, un continuo EMT y un espectro EMT26. Durante la EMT, las células tumorales adquieren propiedades de células madre cancerosas (CSC) y se vuelven más resistentes a la apoptosis inducida pordesprendimientos 27. Mientras que emt es responsable de la adquisición de un fenotipo invasivo en las células tumorales primarias e impulsa la progresión del cáncer, en cambio, la transición mesenquimal-epitelial (MET) ha demostrado desempeñar un papel importante en el crecimiento de las células tumorales diseminadas en sitios metastásicos distantes28,29. Un estudio reciente demostró que las células de cáncer de mama derivadas de EMT pueden ser transdiferenciadas en adipocitos, lo que podría ofrecer una oportunidad para inhibir la metástasis y superar la resistencia terapéutica en las células tumorales y el cáncer recaída30. Debido al importante papel de la señalización TGF-β en la activación de emt en carcinogénesis mamaria, presentamos protocolos detallados para la hinchazón occidental, un ensayo de reportero transcripcional luciferasa, reacción cuantitativa en cadena de polimerasa en tiempo real (qRT-PCR) e inmunofluorescencia para la investigación de la señalización de TGF-β, EMT inducida por TGF-β, y la transdiferenciación de células tumorales epiteliales de mamas murinas derivadas de EMT en adipocitos. Estas técnicas son las herramientas analíticas más utilizadas en el campo de la biología celular. qRT-PCR se utiliza para detectar, caracterizar y cuantificar los niveles de expresión de ARNm de manera cuantitativa. En comparación con el PCR cuantitativo (qPCR), una técnica alternativa, la transcripción inversa (RT)-PCR se puede utilizar para determinar la expresión de ARNm de una manera semicuantitativa31,32. La hinchazón occidental se utiliza para examinar los niveles específicos de proteínas en una muestra de lisato celular dada con ventajas de sensibilidad y especificidad, de una manera semicuantitativa. Por lo tanto, presentamos un flujo de trabajo sistemático para analizar los cambios de la expresión génica a la expresión proteica para ayudar a investigar la señalización β TGF que también se puede aplicar a otras vías de señalización.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mm-side square glass coverslips</td><td>Menzel Gl&amp;auml;ser</td><td>631-1331</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21422</td><td></td></tr><tr><td>Anti-E-cadherin antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td></td></tr><tr><td>anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) antibody</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB374</td><td></td></tr><tr><td>Anti-N-cadherin antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>610920</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Slug antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9585</td><td></td></tr><tr><td>anti-SMAD2/3 antibody</td><td>Becton Dickinson</td><td>610842</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Snail antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3879</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tubulin antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2148</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>Cholera enterotoxin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrate</td><td>Bio-Rad</td><td>1705060</td><td></td></tr><tr><td>DC protein assay kit</td><td>Bio-Rad</td><td>5000111</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-high glucose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-high glucose medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium (DMEM)/F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11039047</td><td></td></tr><tr><td>epidermal growth factor (EGF)</td><td>Merck Millipore</td><td>01-107</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>BioWest</td><td>S1860-500</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>PROMEGA</td><td>A600X</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0135</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91077C</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA II kit</td><td>BIOKE&amp;acute;</td><td>740955</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin (Pen-Strep)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine (PEI)</td><td>Polyscience</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td><td>Merck Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7170</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1621</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>557366-M</td><td></td></tr><tr><td>Skimmed milk</td><td>Campina: Elk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc Imaging System</td><td>Bio-Rad</td><td>17001402</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect Detection System</td><td>Bio-Rad</td><td>1855201</td><td></td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Perkin Elmer</td><td>2030-0050</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr></tbody></table>

studying tgf-&#946; signaling and tgf-&#946;-induced epithelial-to-mesenchymal transition in breast cancer and normal cells

Transformar el factor de crecimiento β (TGF-β) es un factor multifuncional secreto que desempeña un papel clave en la comunicación intercelular. Perturbaciones de la señalización β TGF puede conducir al cáncer de mama. TGF-β provoca sus efectos sobre la proliferación y la diferenciación a través de receptores específicos de superficie celular TGF-β tipo I y tipo II (es decir, TβRI y TβRII) que contienen un dominio intrínsico serina/trionina quinasa. Tras la formación de complejos heteroméricos inducidos por TGF-β, la señalización intracelular TβRI activada provoca mediante la fosforilización SMAD2 y SMAD3. Estos SMAD activados forman complejos heteroméricos con SMAD4 para regular genes objetivo específicos, incluyendo el inhibidor de activación plasminógeno 1 (PAI-1, codificado por el gen SERPINE1). La inducción de la transición epitelial a mesenquimal (EMT) permite que las células epiteliales del cáncer en el sitio primario o durante la colonización en sitios distantes obtengan un fenotipo invasivo e impulsen la progresión tumoral. TGF-β actúa como un potente inductor de la invasión del cáncer de mama mediante la conducción de EMT. Aquí, describimos métodos sistemáticos para investigar la señalización TGF-β y las respuestas EMT utilizando células MCF10A-RAS humanas premalignantes (M2) y células epiteliales NMuMG del ratón como ejemplos. Describimos métodos para determinar la fosforilación SMAD2 inducida por TGF-β mediante hinchazón occidental, actividad transcripcional dependiente de SMAD3/SMAD4 utilizando actividad de reportero luciferasa y expresión génica objetivo SERPINE1 mediante reacción cuantitativa en cadena de polimerasa en tiempo real (qRT-PCR). Además, se describen métodos para examinar la EMT inducida por TGF-β midiendo los cambios en la morfología, la expresión de marcador epitelial y mesenquimal, la tinción de actina filamentosa y la tinción de inmunofluorescencia de E-cadherin. Dos inhibidores selectivos de la quinasa del receptor TGF-β de molécula pequeña, GW788388 y SB431542, se utilizaron para bloquear la fosforilación SMAD2 inducida por TGF-β, los genes objetivo y los cambios en la expresión del marcador EMT. Además, describimos la transdiferenciación de células tumorales epiteliales de células epiteliales de mama mesenquimal en adipocitos. Los métodos para examinar la señalización inducida por TGF-β y la EMT en el cáncer de mama pueden contribuir a nuevos enfoques terapéuticos para el cáncer de mama.

Análisis de la señalización TGF-β El paso clave en la señalización TGF-β es la fosforilación de los dos residuos de serina terminal más carboxígenos en el motivo SSXS (Figura 2) por TβRI quinasa38,39. Para investigar las respuestas de señalización de TGF-β, realizamos la hinchazón occidental de SMAD2 fosforilado. En las células MCF10A-Ras de mama humana premalignante, la fosforilación de SMAD2 aumentó significativamente en respuesta a la estimulación de TGF-β durante 1 hora, mientras que la expresión del SMAD2/3 total no se vio afectada por el tratamiento con TGF-β(Figura 4A). Mediante el uso del ensayo de reportero transcripcional CAGA-luc inducido por TGF-β,4-driven CAGA-luc, encontramos que TGF-β indujo notablemente al reportero luciferasa en la línea de células MCF10A-Ras en comparación con las células no tratadas (Figura 4B). Además, observamos que los objetivos genéticos transcripcionales directos bien caracterizados de TGF-β incluidos SMAD7 y SERPINE1 (codificación de la proteína PAI-1), se expresaban en gran medida en las células MCF10A-Ras tratadas con TGF-β (Figura 4C).
Análisis de TGF-β inducido EMT Evaluamos TGF-β-inducido EMT con varios métodos, tales como cambios morfológicos, la expresión de marcadores EMT en los niveles de ARNm y proteínas y la tinción de inmunofluorescencia de los marcadores EMT36. Las células epiteliales NMuMG tratadas con TGF-β durante 1 y 2 días cambiaron de una morfología epitelial clásica a una morfología mesenquimal en forma de husillo, como se muestra en la microscopía de contraste de fase (Figura 5A). En consonancia con los cambios morfológicos, observamos que el tratamiento con TGF-β condujo a un aumento en la expresión proteica de marcadores mesenquimales, incluyendo N-cadherin, Snail y Slug37 (Figura 5B). Por el contrario, E-cadherin, un marcador epitelial, fue regulado en células NMuMG después de 2 días de tratamiento TGF-β (Figura 5B). Además, realizamos reacciones cuantitativas en cadena de polimerasa en tiempo real (qRT-PCR) para investigar la expresión génica de los marcadores EMT. CDH1 (codificación de la proteína E-cadherin) se redujo significativamente, mientras que los marcadores mesenquimales como SNAIL y Zinc finger E-box-binding homeobox 2 (ZEB2) se incrementaron notablemente después de la estimulación de TGF-β en células NMuMG en comparación con las células no tratadas (Figura 5C). TGF-β-inducido EMT en células NMuMG se confirmó aún más por la tinción de inmunofluorescencia de E-cadherin. Tras la estimulación de TGF-β durante 2 días, las células NMuMG expresaron menos E-cadherin que las células del grupo de control no inducido, analizado por microscopía confocal(Figura 5D). Además, las células NMuMG en presencia de TGF-β formaron más fibras de tensión actina, como se muestra en la microscopía confocal (Figura 5E).
SB431542 y GW788388 inhiben la señalización TGF-β y la EMT inducida por TGF-β SB431542 es un inhibidor competitivo de ATP del dominio quinasa de TβRI, también denominado activin receptor-como quinasa 5 (ALK5), mientras que GW788388 inhibe la actividad de TβRI y TβRII quinasa. Ambos inhibidores pueden inhibir la señalización del receptor TGF-β40. Por lo tanto, tratamos células NMuMG con diferentes concentraciones de GW788388 en presencia de TGF-β durante 1 hora. Como era de esperar, GW788388 inhibió la fosforilación SMAD2 inducida por TGF-β de una manera dependiente de la dosis (Figura 6A). Además, el tratamiento SB431542(Figura 6A)bloqueó la fosforilación mediada por TGF-β de SMAD2. El SMAD2/3 fosforilado forma un complejo heteromérico con SMAD4 y se transloca en el núcleo para modular la transcripción de genes objetivo. Por lo tanto, investigamos la translocación de SMAD2/3 en células NMuMG por tinción de inmunofluorescencia de SMAD2/3. Los datos demostraron que tanto SB431542 como GW788388 inhibieron significativamente la translocación nuclear inducida por TGF-β y la acumulación de SMAD2/3 en células NMuMG (Figura 6B). Además, los efectos inhibitorios de SB431542 y GW788388 también se observaron en los niveles de expresión de ARNM de genes diana importantes β TGF implicados en emt, incluidos PAI-1, SNAIL, E-cadherin y fibronectina (Figura 6C). Estos datos sugirieron que SB431542 y GW788388 bloquearon la señalización TGF-β y la EMT inducida por TGF-β.
Análisis de la transdiferenciación de las células mesenquimales del cáncer de mama en adipocitos Emt desempeña un papel vital en la mejora de la plasticidad celular en los cánceres y resulta en el desarrollo de la resistencia a la terapia. La plasticidad de las células cancerosas puede dirigirse e inhibirse directamente con un enfoque de diferenciación trans, como la adipogénesis forzada30. Utilizamos células de cáncer de mama murina Py2T, que se derivaron de la glándula mamaria de un ratón mammary tumor-polioma tumor-antígeno medio (MMTV-PyMT) ratón transgénico, como un modelo celular de plasticidad de células cancerosas inducida por EMT. Sobre la base de un protocolo establecido41,tratamos células de cáncer de mama de py2T murcianas derivadas de EMT con el fármaco antidiabético rosiglitazona durante 10 días para inducir la adipogenesis. La adipogenesis se evaluó visualizando gotas lipídicas utilizando manchas de O de color rojo aceite. Las células grasas se detectaron fácilmente en células de cáncer de mama de py2T murcianas tratadas con rosiglitazona(Figura 7),que demostraron que el tratamiento solo con rosiglitazona es suficiente para promover la transdiferenciación de las células de cáncer de mama derivadas de la EMT en adipocitos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig01.jpg"> Figura 1: Señalización TGF-β/SMAD. La señalización TGF-β inicia con la unión de TGF-β al receptor TGF-β tipo II (TβRII), una quinasa constitutivamente activa, que fosforila el receptor TGF-β tipo I (TβRI). A continuación, el fosforilatos de quinasa TβRI activados SMAD2/3. Se utilizó un péptido que contenía el motivo SSXS de SMAD2 con dos residuos de serina fosforilada terminal carboxígena para obtener antisera policlonal reconociendo fósforo-SMAD2 (p-SMAD2). Por lo tanto, el análisis de la expresión p-SMAD2 por hinchazón occidental se puede utilizar para determinar la activación de la vía de señalización TGF-β. El SMAD2/3 fosforilado puede formar complejos heteroméricos con SMAD4, que luego se translocan en el núcleo para modular las respuestas transcripcionales. El ensayo del reportero12-luciferasa y el PCR cuantitativo en tiempo real (qRT-PCR) para la expresión de ARNM de genes objetivo β TGF como SMAD7 y SERPINE1 (proteína PAI-1 codificación), se pueden utilizar para analizar respuestas transcripcionales dependientes del SMAD3 inducidas por TGF-β. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig02.jpg"> Figura 2: Estructura esquemática de R-SMADs (SMAD2 y SMAD3). Los dominios MH1 (azul) y MH2 (amarillo) se conservan entre R-SMADs, pero la región del vinculador (gris) no se conserva. El dominio MH1 de SMAD3 alberga un motivo de unión al ADN, mientras que SMAD2 no puede unir directamente el ADN, debido a una inserción (exon 3) en su dominio MH1. El dominio MH2 media la oligomerización SMAD, la interacción con los receptores TGF-β y la unión a proteínas y participa en la regulación transcripcional. SMAD2 y SMAD3 se pueden activar mediante la fosforilación del motivo SSXS (en rojo) en su C termini. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig03.jpg"> Figura 3: TGF-β-inducido EMT. Durante la transición epitelial-mesenquimal inducida por TGF-β (EMT), las células sufren pérdida de epitelial y adquisición de características mesenquimales con mayor motilidad celular y capacidad de invasión. La inducción de emt conduce a la expresión de marcadores mesenquimales como N-cadherin, Zeb2, y Snail1/2, así como la regulación descendente de marcadores epiteliales incluyendo E-cadherin, β-catenina, y claudin-1. La pérdida o ganancia acumulada de características epiteliales/mesenquimales (E/M) hace que una célula entre en estados intermedios de manera reversible. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig04.jpg"> Figura 4: TGF-β las respuestas de señalización en las células MCF10A-Ras. (A) Las células MCF10A-Ras fueron tratadas con o sin TGF-β (2.5 ng/mL) durante 1 hora, y los liatos celulares fueron inmunoblotted para SMAD2 fosforilado (p-SMAD2), SMAD2/3 total y GAPDH (como control de carga). El marcador de tamaño se muestra a la derecha. Contra: Grupo de control sin tratamiento TGF-β. B) Análisis de la actividad de TGF-β (5 ng/mL) utilizando el reportero transcripcional12-luciferasa (LUC) dependiente de SMAD3-SMAD4 en células MCF10A-Ras. Los valores se normalizan a β-galactosidasa (βGal). Los datos se expresan como la media ± s.d, n = 3. Prueba de t del estudiante, ***P ≤ 0.001 (C) análisis qRT-PCR de los genes diana TGF-β SMAD7 y SERPINE1 (codificación de la proteína PAI-1) en células MCF10A-Ras tratadas con TGF-β (2,5 ng/mL) durante 6 horas. GAPDH se utilizó como control interno. Los datos se expresan como la media ± s.d, n = 3. Prueba del estudiante, ***P ≤ 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig05.jpg"> Figura 5: TGF-β-inducido EMT en células NMuMG. (A) Morfología de células NMuMG tratadas con TGF-β (2,5 ng/mL) durante 1 o 2 días. En presencia de TGF-β, células NMuMG transdiferenciadas en un fenotipo mesenquimal. Barra de escala = 150 células NMuMG de μm (B) fueron tratadas con o sin TGF-β (5 ng/mL) durante 2 días, y los marcadores EMT fueron analizados por la hinchazón occidental. El marcador de tamaño es como se indica a la derecha. Contra: Grupo de control sin tratamiento TGF-β. (C) Análisis de expresión génica de marcadores EMT(CDH1 (codificación de la proteína E-cadherin), SNAIL y ZEB2) en células NMuMG tratadas durante 2 días con TGF-β (5 ng/mL). GAPDH se utilizó como control interno. Los resultados se expresan como la media ± s.d., n = 3. Prueba t del estudiante, *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001. (D) Las células NMuMG fueron manchadas por inmunofluorescencia para detectar la expresión del marcador epitelial E-cadherin (rojo) después del tratamiento TGF-β (2.5 ng/mL) durante 2 días. Los nuclei fueron contradelados con DAPI (azul). Las imágenes fueron capturadas con microscopía confocal. Barra de escala = 50 μm (E) Células NMuMG fueron manchadas con fluoresceína-faloides (verde) para visualizar F-actin. Los nuclei fueron contradelados con DAPI (azul). Barra de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig06.jpg"> Figura 6: TGF-βsignaling y TGF-β-induced EMT fueron inhibidos por SB431542 y GW788388. (A) Las células NMuMG fueron tratadas con 10 μM de SB431542 (SB) o las concentraciones indicadas de GW788388 (GW) en presencia o ausencia de TGF-β (5 ng/mL) durante 1 hora. Los lysatos celulares fueron inmunoblotted para p-SMAD2, SMAD2/3 y GAPDH. (B) Las células NMuMG fueron tratadas con 5 μM de SB431542 (SB) o 10 μM de GW788388 (GW) en presencia o ausencia de 5 ng/mL de TGF-β durante 1 hora y manchadas por inmunofluorescencia para detectar la translocación nuclear de SMAD2/3 (verde). Las imágenes fueron capturadas con microscopía confocal. (C) La expresión de genes objetivo β TGF, incluyendo PAI-1 y genes que codifican marcadores EMT, incluyendo SNAIL, E-Cadherin y Fibronectin, fueron analizados por reacción inversa en cadena de la polimerasa transcriptasa (RT-PCR) en células NMuMG después del tratamiento SB o GW y estimulación de TGF-β durante 48 horas. GAPDH sirvió como control de carga. Control denota celdas no tratadas. Esta cifra ha sido modificada de Petersen M. et al. 34 con permiso del editor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig07.jpg"> Figura 7: Las células de cáncer de mama de py2T murcianas derivadas de emt pueden ser inducidas a diferenciarse en adipocitos. Las células de cáncer de mama de py2T murine fueron estimuladas con 2 ng/mL TGF-β durante 20 días para inducir la EMT completa. Luego, las células fueron tratadas con DMSO como control del vehículo o rosiglitazona (2 μM) durante 10 días para permitir la diferenciación de las células cancerosas mesenquimales e inducir adipogénesis. El medio se cambiaba cada 2 días. Después de 10 días de tratamiento, las células fueron manchadas con aceite rojo O. Barra de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig07large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>especie</td>
			<td>Nombre genético</td>
			<td colspan="2">Delantero (5' a 3')</td>
			<td colspan="2">Reverso (5' a 3')</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Humano</td>
			<td>GAPDH</td>
			<td colspan="2">TGCACCACCAACTGCTTAGC</td>
			<td colspan="2">GGCATGGACTGTGGTCATGAG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SMAD7</td>
			<td colspan="2">TCCAGATGCTGTGCCTTCC</td>
			<td colspan="2">GTCCGAATTGAGCTGTCCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SERPINE1</td>
			<td colspan="2">CACAAATCAGACGGCAGCACT</td>
			<td colspan="2">CATCGGGCGTGGTGAACTC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">ratón</td>
			<td>GAPDH</td>
			<td colspan="2">TGGCAAAGTGGAGATTGTTGCC</td>
			<td colspan="2">AAGATGGTGATGGGCTTCCCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>CDH1</td>
			<td colspan="2">ACCAAAGTGACGCTGAAGTC</td>
			<td colspan="2">GAGGATGTACTTGGCAATGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>caracol</td>
			<td colspan="2">CAGCTGGCCAGGCTCTCGGT</td>
			<td colspan="2">GCGAGGGCCTCCGGAGCA</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZEB2</td>
			<td colspan="2">TTCTGCAAGCCTCTGTAGCC</td>
			<td colspan="2">TTCTGGCCCCATTGCATCAT</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Imprimaciones utilizadas para qRT-PCR.

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Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Describimos un flujo de trabajo sistemático para investigar la señalización β TGF y la EMT inducida por TGF-β mediante el estudio de la proteína y la expresión génica implicadas en esta vía de señalización. Los métodos incluyen hinchazón occidental, un ensayo de reportero luciferasa, qPCR y tinción de inmunofluorescencia.

Estudio de la señalización β TGF y la transición epitelial a mesenquimal inducida por TGF-β en cáncer de mama y células normales

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...

studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal

Research

JoVE Journal

Cancer Research

12.7K vistas.  Leiden University Medical Center. Describimos un flujo de trabajo sistemático para investigar la señalización β TGF y la EMT inducida por TGF-β mediante el estudio de la proteína y la expresión génica implicadas en esta vía de señalización. Los métodos incluyen hinchazón occidental, un ensayo de reportero luciferasa, qPCR y tinción de inmunofluorescencia.

Video: Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

Ensayo esferoide para medir TGF-β inducida por invasión

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Investigación

Medicina

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is the formation of fibroblastic foci, which is associated with the disease severity. Mesenchymal cells consisting of the fibroblastic foci are proposed to be derived from several cell sources, including originally resident intrapulmonary fibroblasts and circulating fibrocytes from bone marrow. Recently, mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition (EMT) have been also supposed to contribute to the pathogenesis of fibrosis. In addition, EMT can be induced by transforming growth factor &#946;, and EMT can be enhanced by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor &#945;. The gel contraction assay is an ideal in vitro model for the evaluation of contractility, which is one of the characteristic functions of fibroblasts and contributes to wound repair and fibrosis. Here, the development of a gel contraction assay is demonstrated for evaluating contractile ability of mesenchymal cells that underwent EMT.

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Here, we describe the development and application of a gel contraction assay for evaluating contractile function in mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition.

Desarrollo de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayo para evaluar la función contráctil de las células mesenquimales que la transición epitelio-mesenquimal Sufrió

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Biología del Desarrollo

Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic plasticity drives invasion, dissemination and metastasis. Indeed, while most of the studies of phenotypic plasticity have been in the context of epithelial-derived carcinomas, it turns out sarcomas, which are mesenchymal in origin, also exhibit phenotypic plasticity, with a subset of sarcomas undergoing a phenomenon that resembles a mesenchymal-epithelial transition (MET). Here, we developed a method comprising the miR-200 family and grainyhead-like 2 (GRHL2) to mimic this MET-like phenomenon observed in sarcoma patient samples.We sequentially express GRHL2 and the miR-200 family using cell transduction and transfection, respectively, to better understand the molecular underpinnings of these phenotypic transitions in sarcoma cells. Sarcoma cells expressing miR-200s and GRHL2 demonstrated enhanced epithelial characteristics in cell morphology and alteration of epithelial and mesenchymal biomarkers. Future studies using these methods can be used to better understand the phenotypic consequences of MET-like processes on sarcoma cells, such as migration, invasion, metastatic propensity, and therapy resistance.

We present here a cell culture method for inducing mesenchymal-epithelial transitions (MET) in sarcoma cells based on combined ectopic expression of microRNA-200 family members and grainyhead-like 2 (GRHL2). This method is suitable for better understanding the biological impact of phenotypic plasticity on cancer aggressiveness and treatments.

La inducción de la mesenquimales-epitelial Transitions en células de sarcoma

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic ...

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction of differentiation of two mouse breast epithelial cell lines, HC11 and EpH4, and their use to study complementary stages of mammary gland development and neoplastic transformation.
The HC11 mouse breast epithelial cell line originated from the mammary gland of a pregnant Balb/c mouse. It differentiates when grown to confluence attached to a plastic Petri dish surface in medium containing fetal calf serum and Hydrocortisone, Insulin and Prolactin (HIP medium). Under these conditions, HC11 cells produce the milk proteins &#946;-casein and whey acidic protein (WAP), similar to lactating mammary epithelial cells, and form rudimentary mammary gland-like structures termed &#34;domes&#34;.
The EpH4 cell line was derived from spontaneously immortalized mouse mammary gland epithelial cells isolated from a pregnant Balb/c mouse. Unlike HC11, EpH4 cells can fully differentiate into spheroids (also called mammospheres) when cultured under three-dimensional (3D) growth conditions in HIP medium. Cells are trypsinized, suspended in a 20% matrix consisting of a mixture of extracellular matrix proteins produced by Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma cells, plated on top of a layer of concentrated matrix coating a plastic Petri dish or multiwell plate, and covered with a layer of 10% matrix-containing HIP medium. Under these conditions, EpH4 cells form hollow spheroids that exhibit apical-basal polarity, a hollow lumen, and produce &#946;-casein and WAP.
Using these techniques, our results demonstrated that the intensity of the cadherin/Rac signal is critical for the differentiation of HC11 cells. While Rac1 is necessary for differentiation and low levels of activated RacV12 increase differentiation, high RacV12 levels block differentiation while inducing neoplasia. In contrast, EpH4 cells represent an earlier stage in mammary epithelial differentiation, which is inhibited by even low levels of RacV12.

We describe techniques for differentiation induction of two breast epithelial lines, HC11 and EpH4. While both require fetal calf serum, insulin, and prolactin to produce milk proteins, EpH4 cells can fully differentiate into mammospheres in three-dimensional culture. These complementary models are useful for signal transduction studies of differentiation and neoplasia.

Diferenciación de células epiteliales de mama de ratón HC11 y EpH4

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

Investigación sobre el cáncer

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the actual molecules towards which the cells migrate remain elusive. This modified invasion assay has been developed to identify targets which drive cell migration and invasion. This technique compares the invasion index under three conditions to determine whether a specific hormone, growth factor, or cytokine plays a role in mediating the invasive potential of a cancer cell. These conditions include i) normal fetal bovine serum (FBS), ii) charcoal-stripped FBS (CS-FBS), which removes hormones, growth factors, and cytokines and iii) CS-FBS + molecule (denoted &#8220;X&#8221;). A significant change in cell invasion with CS-FBS as compared to FBS, indicates the involvement of hormones, cytokines or growth factors in mediating the change. Individual molecules can then be added back to CS-FBS to assay their ability to reverse or rescue the invasion phenotype. Furthermore, two or more factors can be combined to evaluate the additive or synergistic effects of multiple molecules in driving or inhibiting invasion. Overall, this method enables the investigator to determine whether hormones, cytokines, and/or growth factors play a role in cell invasion by serving as chemoattractants or inhibitors of invasion for a particular type of cancer cell or a specific mutant. By identifying specific chemoattractants and inhibitors, this modified invasion assay may help to elucidate signaling pathways that direct cancer cell invasion.

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

Un Modificado<em&gt; In vitro</em&gt; Invasión Ensayo para determinar el papel potencial de hormonas, citoquinas y / o factores de crecimiento en la invasión de células del cáncer de Mediación

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and mechanical stability, and represents a core element of multi-cellular animal life. In adherent cells, acto-myosin contraction is seen in traction forces that cells exert on their substrate. Dysregulation of cellular contractility appears in a myriad of pathologies, making contractility a promising target in diverse diagnostic approaches using biophysics as a metric. Moreover, novel therapeutic strategies can be based on correcting the apparent malfunction of cell contractility. These applications,&#160;however, require direct quantification of these forces.
We have developed silicone elastomer-based traction force microscopy (TFM) in a parallelized multi-well format. Our use of a silicone rubber, specifically polydimethylsiloxane (PDMS), rather than the commonly employed hydrogel polyacrylamide (PAA) enables us to make robust and inert substrates with indefinite shelf-lives requiring no specialized storage conditions. Unlike pillar-PDMS based approaches that have a modulus in the GPa range, the PDMS used here is very compliant, ranging from approximately 0.4 kPa to 100 kPa. We create a high-throughput platform for TFM by partitioning these large monolithic substrates spatially into biochemically independent wells, creating a multi-well platform for traction force screening that is compatible with existing multi-well systems.
In this manuscript, we use this multi-well traction force system to examine the Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT); we induce EMT in NMuMG cells by exposing them to TGF-&#946;, and to quantify the biophysical changes during EMT. We measure the contractility as a function of concentration and duration of TGF-&#946; exposure. Our findings here demonstrate the utility of parallelized TFM in the context of disease biophysics.

We present a high throughput traction force assay fabricated with silicone rubber (PDMS). This novel assay is suitable for studying physical changes in cell contractility during various biological and biomedical processes and diseases. We demonstrate this method's utility by measuring a TGF-&#946; dependent increase in contractility during the epithelial-to-mesenchymal transition.

Microscopía de fuerza de tracción de alto rendimiento Mediante PDMS revela efectos dependientes de la dosis de transformar el factor de crecimiento en la transición epitelial a mesenquimal

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Bioingeniería

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Inducción y Análisis de epitelial a mesenquimal de transición

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Biología

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Detección de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal de transición

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with organ fibrosis. In these conditions, differentiated endothelial cells acquire mesenchymal-like phenotypes. This process is called endothelial-mesenchymal transition (EndMT) and is characterized by downregulation of endothelial markers, upregulation of mesenchymal markers, and morphological changes. EndMT is induced by several signaling pathways, including transforming growth factor (TGF)-&#946;, Wnt, and Notch, and regulated by molecular mechanisms similar to those of epithelial-mesenchymal transition (EMT) important for gastrulation, tissue fibrosis, and cancer metastasis. Understanding the mechanisms of EndMT is important to develop diagnostic and therapeutic approaches targeting EndMT. Robust induction of EndMT in vitro is useful to characterize common gene expression signatures, identify druggable molecular mechanisms, and screen for modulators of EndMT. Here, we describe an in vitro method for induction of EndMT. MS-1 mouse pancreatic microvascular endothelial cells undergo EndMT after prolonged exposure to TGF-&#946; and show upregulation of mesenchymal markers and morphological changes as well as induction of multiple inflammatory chemokines and cytokines. Methods for the analysis of microRNA (miRNA) modulation are also included. These methods provide a platform to investigate mechanisms underlying EndMT and the contribution of miRNAs to EndMT.

A protocol for in vitro induction of endothelial-mesenchymal transition (EndMT), which is useful for investigating cellular signaling pathways involved in EndMT, is described. In this experimental model, EndMT is induced by treatment with TGF-&#946; in MS-1 endothelial cells.

Análisis molecular de transición endotelio-mesénquima inducida por transformación de señalización del Factor de crecimiento β

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like phenotype, a process that is termed endothelial to mesenchymal transition (EndMT). Emerging results have suggested that EndMT is causally linked to multiple human diseases, such as fibrosis and cancer. In addition, endothelial-derived mesenchymal cells may be applied in tissue regeneration procedures, as they can be further differentiated into various cell types (e.g., osteoblasts and chondrocytes). Thus, the selective manipulation of EndMT may have clinical potential. Like epithelial-mesenchymal transition (EMT), EndMT can be strongly induced by the secreted cytokine transforming growth factor-beta (TGF-&#946;), which stimulates the expression of so-called EndMT transcription factors (EndMT-TFs), including Snail and Slug. These EndMT-TFs then up- and downregulate the levels of mesenchymal and endothelial proteins, respectively. Here, we describe methods to investigate TGF-&#946;-induced EndMT in vitro, including a protocol to study the role of particular TFs in TGF-&#946;-induced EndMT. Using these techniques, we provide evidence that TGF-&#946;2 stimulates EndMT in murine pancreatic microvascular endothelial cells (MS-1 cells), and that the genetic depletion of Snail using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)-mediated gene editing, abrogates this phenomenon. This approach may serve as a model to interrogate potential modulators of endothelial biology, and can be used to perform genetic or pharmacological screens in order to identify novel regulators of EndMT, with potential application in human disease.

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

We describe methods to investigate TGF-&#946;2-induced EndMT in endothelial cells by observing cell morphology changes and examining the expression EndMT-related marker changes using immunofluorescence staining. CRISPR/Cas9 gene editing was described and used to deplete the gene encoding Snail to investigate its role in TGF-&#946;2-induced EndMT.

TGF-β mediada por la transición endotelial a mesenquimal (EndMT) y la evaluación funcional de los efectores endMT utilizando la edición de genes CRISPR / Cas9

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like ...

Estudio de la señalización β TGF y la transición epitelial a mesenquimal inducida por TGF-β en cáncer de mama y células normales

Resumen

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