Riconosciamo il sostegno del Chinese Scholarship Council (CSC) al J.Z. and Cancer Genomics Centre Netherlands (CGC. NL) a P.t.D.

1. Analisi della fosforilazione SMAD2 indotta da TGF-β utilizzando l'assorbimento occidentale
NOTA: Le cellule MCF10A-Ras del seno umano premalignant sono state utilizzate come esempio per indagare le risposte di segnalazione βTGF-β 33. In linea di principio, i metodi descritti di seguito sono applicabili anche ad altre linee cellulari β TGF-β reattive.
<ol><li>Coltura della linea cellulare epiteliale del seno MCF10A-Ras a 37 °C nel mezzo dell'Aquila modificato di Dulbecco (DMEM)/F12 contenente L-glutammina con siero di cavallo al 5%, 20 ng/mL fattore di crescita epidermico (EGF), 10 mg/mL di insulina, 100 ng/mL enterotossina colera, 0,5 mg/mL idrocortisone e 1:100 penicillina-streptomicina (Pen-Strep).</li>
	<li>Tripinare le cellule MCF10A-Ras con 1 mL dello 0,25% di tripsiderina-EDTA per 1 minuto e contare le cellule vitali utilizzando un contatore di celle.</li>
	<li>Cellule di semi in piastre a 6 po 'ad una densità di 5×105 cellule / pozzo.</li>
	<li>Dopo la crescita durante la notte, trattare le cellule con TGF-β (5 ng/mL) o tampone di ligando (4 mM HCl, 0,1% di albumina di siero bovino priva di acidi grassi (BSA)) per 1 ora, quindi rimuovere il mezzo di coltura e lavare delicatamente le cellule due volte con 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).</li>
	<li>Raffreddare le cellule in piastre a 6 po po' di ghiaccio e aggiungere 150 μL di tampone di analisi di lysis radio immune preraffreddato (RIPA) (150 mM NaCl, 0,1% Tritone X-100, 0,5% deossicholato di sodio, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8.0 e cocktail inibitore della mini proteasi appena aggiunto). Lasciare procedere lalisi sul ghiaccio per 10 minuti.</li>
	<li>Raschiare le cellule aderenti dal piatto utilizzando un raschietto a celle di plastica, quindi trasferire delicatamente la sospensione cellulare in un tubo di microcentrifugo preraffreddato.</li>
	<li>Centrifugare il lysate cellulare per 10 minuti a 150 forza centrifuga (x g) a 4 °C e trasferire il supernatante in un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,5 ml.</li>
	<li>Misurare la concentrazione proteica utilizzando un kit di dosaggio proteico compatibile con detergente (DC).</li>
	<li>Caricare 30 μg di proteine da ciascun campione su un gel di elettroforesi del gel di poliacrilammide di dodecil solfato di sodio al 10% (SDS-PAGE) ed eseguire il gel a una tensione di 100 V per 1,5-2 ore.</li>
	<li>Trasferire le proteine dal gel a una membrana di difluoruro di polivinilidene da 45 μm (PVDF) ad una tensione di 110 V per 1-1,5 ore.</li>
	<li>Trasferire la membrana PVDF in un contenitore appropriato con il lato proteico (il lato che si affacciava sul gel) verso l'alto e sciacquare brevemente la membrana in acqua distillata.</li>
	<li>Scartare l'acqua, aggiungere la soluzione Ponceau S e mettere la membrana su una piattaforma a dondolo per 1-2 minuti.</li>
	<li>De-macchiare la membrana con acqua distillata risciacquarla rapidamente e quindi lavarla per 1 minuto.</li>
	<li>Quindi, metti la membrana PVDF su una scatola di luce e scatta una foto per verificare la parità di carichi totali di proteine.</li>
	<li>Lavare la membrana con soluzione salina tris-tamponata con Tween 20 (TBST, Tris-HCl da 20 mM, pH 7,4, NaCl da 150 mM e 0,1% di Interpol 20) fino a quando non vi è alcuna colorazione visibile.</li>
	<li>Mettere la membrana nel tampone di blocco (5% di latte scremato in soluzione TBST) e incubarla per 1 ora a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare la membrana due volte con TBST.</li>
	<li>Incubare la membrana con anticorpi primari contro il fosfo-SMAD2 (p-SMAD2; 1:1000, fatto in casa 34),totale SMAD2/3 1:1000 e gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (GAPDH; 1:1000), durante la notte a 4 °C.</li>
	<li>Lavare la membrana due volte con TBST e incubare la membrana con un anticorpo secondario contro coniglio o topo (1:5000) per 2 ore.</li>
	<li>Incubare la membrana PVDF con il substrato ECL occidentale per 30 secondi e rilevare il segnale utilizzando un sistema di imaging.</li>
	<li>Ripetere gli esperimenti almeno tre volte per ottenere triplicati biologici.</li>
</ol>2. Analisi delle risposte trascritte β SMAD3 indotte da TGF
<ol><li>Eseguire il test del reporter trascrizionale CAGA12-luciferase dipendente da SMAD3/SMAD4.<ol>
<li>Coltura e tripsininare le celle MCF10A-Ras come descritto nel passaggio 1. Seminare le cellule in piastre da 24 pozzi a 5×104 cellule / bene e consentire alle cellule di aderire durante la notte.</li>
		<li>Il giorno dopo la semina, cotrasfezionare le cellule in ogni pozzo con 100 ng del TGF-β/SMAD3-inducibile (CAGA)12 luciferasi trascrizionale reportercostruire 35 e 80 ng del costrutto di espressione β-galattosidasi usando polietilenimina (PEI). La trasfezione β-galattosidasi è usata per normalizzare le differenze nell'efficienza di trasfezione tra diversi pozzi. Impostare ogni gruppo sperimentale in triplice copia.</li>
		<li>Dopo 24 ore di incubazione, le cellule affamate con glucosio alto DMEM privo di siero e, 6 ore dopo, aggiungere TGF-β (5 ng / mL) o tampone di ligando (4 mM HCl, 0,1% BSA) come controllo del veicolo alle cellule.</li>
		<li>Dopo altre 24 ore di incubazione, lavare le cellule due volte con PBS prebellici.</li>
		<li>Aggiungere 120 μL/ben 1× tampone di lysis e agitare delicatamente la piastra a 4 °C per 20 minuti.</li>
		<li>Trasferire 30 μL di lisato in ogni pozzo di una micropiatta bianca da 96 pozzi per misurare l'attività della luciferasi usando un luminometro.</li>
		<li>Trasferire 50 μL di lysate in ogni pozzo di una piastra trasparente da 96 po 'per misurare l β-galattosidasi.</li>
		<li>Normalizzare l'attività della luciferasi all'β-galattosidasi e ripetere gli esperimenti almeno tre volte per ottenere triplicati biologici.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analizzare l'espressione dei geni bersaglio β TGF utilizzando la reazione quantitativa a catena in tempo reale-polimerasi (qRT-PCR).<ol>
<li>Coltura e tripsininare le celle MCF10A-Ras come descritto nel passaggio 1. Seminare le cellule in piastre a 6 pozzi a 5×105 cellule / bene e consentire alle cellule di aderire durante la notte.</li>
		<li>Trattare le cellule con TGF-β (5 ng/mL) o tampone di ligando (4 mM HCl, 0,1% di BSA) per 6 ore, quindi lavare le cellule due volte con 1 mL di PBS.</li>
		<li>Isolare l'RNA totale utilizzando un kit di isolamento dell'RNA.</li>
		<li>Determinare la concentrazione di RNA con un NanoDrop ed eseguire la sintesi di cDNA con 1 μg di RNA utilizzando un primo kit di sintesi cDNA a filo.</li>
		<li>Utilizzare un sistema di rilevamento PCR in tempo reale per eseguire pcr quantitativi in tempo reale (qRT-PCR) con cDNA diluito dieci volte in una miscela di reazione da 10 μL che include specifici primer umani avanti e indietro per GAPDH (per la normalizzazione), SERPINE1 (codifica per la proteina PAI-1, un gene bersaglio TGF-β/SMAD),SMAD7 (gene bersaglio TGF-β/SMAD) e qPCR Master Mix. Impostare ogni gruppo sperimentale in triplice copia. NOTA: Le sequenze primer utilizzate per rilevare i geni umani bersaglio in qRT-PCR sono elencate nella tabella 1.</li>
		<li>Utilizzare le seguenti condizioni di reazione qPCR: inizializzazione, 95 °C per 3 minuti; denaturazione, 95 °C per 10 secondi; ricottura, 60 °C per 30 secondi; e estensione, 80 °C per 10 secondi; denaturazione, ricottura ed estensione vengono ripetuti 40 volte.</li>
		<li>Ripetere gli esperimenti almeno tre volte per ottenere triplicati biologici.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Analisi dell'EMT indotto β TGF
<ol><li>Analizzare l'espressione dei marcatori EMT a livello proteico usando western blotting. NOTA: L'analisi dell'EMT indotto β TGF-β viene mostrata utilizzando cellule epiteliali NMuMG del mousecome esempio 36,37.<ol>
<li>Coltura NMuMG cellule a 37 °C in mezzo di glucosio ad alto DMEM integrato con siero bovino fetale al 10% e 1:100 Pen-Strep. Utilizzare metodi descritti nel passaggio 1 per l'isolamento e il rilevamento delle proteine. NOTA: In questo esperimento vengono utilizzati i seguenti anticorpi: E-cadherina, 1:1000; N-cadherina, 1:1000; Lumaca, 1:1000; Lumaca, 1:1000; Tubulina, 1:1000 (Figura 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analizzare l'espressione dei marcatori EMT a livello di mRNA utilizzando quantitative real-time-PCR come descritto nel passaggio 2.2. NOTA: Tutti i primer del mouse utilizzati per qRT-PCR, inclusi CDH1 (codifica della proteina E-cadherina), SNAILe ZEB2 (Figura 3) sono elencati nella tabella 1.</li>
	<li>Analizzare il processo EMT utilizzando l'immunofluorescenza indiretta e la colorazione a fluorescenza diretta.<ol>
<li>Colorazione indiretta dell'immunofluorescenza dell'E-cadherina<ol>
<li>Posizionare sterili coprispatte quadrate laterali da 18 mm in lastre da 6 pozzi (una coverlip per pozzo).</li>
			<li>Seme 1×105 cellule NMuMG con 2 mL di DMEM completo per piastra a 6 porri e consentire alle cellule di aderire durante la notte.</li>
			<li>Spostare delicatamente i copripazzi con celle aderenti su una nuova piastra a 6 pozzi e aggiungere 2 mL di mezzo di coltura ai pozzi.</li>
			<li>Trattare le cellule con TGF-β (5 ng/mL) o tampone ligando (4 mM HCl, 0,1% BSA) per 2 giorni.</li>
			<li>Rimuovere il mezzo di coltura e lavare delicatamente le cellule due volte con 1 mL di PBS prebellico.</li>
			<li>Fissare le cellule aggiungendo 1 mL di paraformaldeide al 4% e incubando per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare delicatamente le cellule due volte con 1 mL di PBS.</li>
			<li>Permeabilizzare le celle fisse con lo 0,1% di Tritone X-100 per 10 minuti a temperatura ambiente e lavare le celle due volte con PBS.</li>
			<li>Bloccare le celle con 5% di BSA in PBS per 1 ora a temperatura ambiente e lavare le celle due volte con PBS.</li>
			<li>Aggiungere l'anticorpo primario contro l'E-cadherina (diluito 1:1000 in PBS) nella parte superiore di ogni coverlip e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.</li>
			<li>Rimuovere l'anticorpo primario e lavare il coverslip con PBS tre volte.</li>
			<li>Aggiungere l'anticorpo secondario Alexa Fluor 555 (diluito 1:500 in PBS) nella parte superiore di ogni coverlip e incubare per 1 ora a temperatura ambiente mentre si copre con un foglio di alluminio per proteggere dalla luce.</li>
			<li>Rimuovere l'anticorpo secondario e lavare il coverslip con PBS tre volte.</li>
			<li>Montare il coverslip (celle rivolte verso il basso) su vetrini utilizzando un mezzo di montaggio con 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) e conservare le diapositive montate in una scatola a 4 °C, protetta dalla luce.</li>
			<li>Osservare la colorazione con microscopia confocale SP8.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Colorazione a fluorescenza diretta dell'actina filamentosa (F).<ol>
<li>Preparare campioni seguendo i passaggi 3.3.1.1. al 3.3.1.9.</li>
			<li>Macchiare le cellule aggiungendo Alexa Fluor 488 Phalloidin (1:1000) per 1 ora a temperatura ambiente al buio per visualizzare l'actina filamentosa (F-actin).</li>
			<li>Lavare le celle tre volte con PBS.</li>
			<li>Montare il coverslip su vetrini utilizzando un supporto di montaggio con DAPI e scattare immagini con microscopia confocale SP8.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La segnalazione TGF-β/SMAD svolge un ruolo fondamentale nella progressione del cancro al seno, in quanto può promuovere l'invasività e la metastasi delle cellule tumorali del seno inducendo EMT7. Qui, abbiamo descritto un flusso di lavoro logico per indagare la segnalazione avviata da TGF-β dall'attivazione SMAD indotta dal recettore alle risposte trascrizionale e biologiche mediate da SMAD. Abbiamo iniziato descrivendo l'analisi della fosforilazione SMAD2, proseguita con le risposte trascrittive dipendenti da SMAD3 indotte da TGF-β e l'espressione marcatore EMT sia a livello genico che proteico per analizzare la risposta di segnalazione TGF-β/SMAD, e infine abbiamo esaminato l'EMT indotta da TGF-β. Abbiamo utilizzato il reporter trascrizionale CAGA12-luciferase contenente scatole CAGA derivate dal promotore PAI-1, per monitorare l'attività della via di segnalazione TGF-β/SMAD35. Questo costrutto reporter richiede SMAD3 e SMAD4 per l'attivazione. Studi precedenti hanno dimostrato che il knockdown di SMAD4 attenuato TGF-β indotto CAGA12-luciferasiattività 37. Oltre al saggio del reporter, determinare lo stato di fosforilazione degli SMAD endogeni, tra cui SMAD2 e SMAD3, è un altro modo per indagare la risposta di segnalazione del TGF-β. Infatti, anche altri membri della famiglia TGF-β, come il fattore di crescita e differenziazione (GDF)-8/miostatina e GDF-9, trasducono segnali tramite proteine SMAD2/3 impegnando TβRI42,43,44. Oltre al reporter CAGA12-luciferase, diversi reporter simili sono stati utilizzati per rilevare l'attivazione del TGF-β segnalazione. Ad esempio, un reporter trascrizionale (SBE)4-Lux con elementi di risposta derivati dal promotore JunB può essere indotto in modo efficiente da TGF-β, attivatine e BMP45.
L'blotting occidentale e il qPCR sono stati usati per analizzare l'EMT indotto da TGF-β, che sono metodi classici per indagare l'espressione di marcatori epiteliali (cioè E-cadherina) e marcatori mesenchimali (cioè N-cadherina, Lumaca, Lumaca e Zeb2). Abbiamo anche eseguito la colorazione indiretta dell'immunofluorescenza dell'E-cadherina e la colorazione a fluorescenza diretta dell'F-actina. Questi test hanno ulteriormente convalidato il fenotipo mesenchimale delle cellule dopo il trattamento con β TGF. La limitazione della colorazione dell'immunofluorescenza è che le cellule devono essere fissate prima dell'incubazione con anticorpi e imaging, ed è difficile indagare i cambiamenti nell'espressione del marcatore EMT nelle cellule vive. Recentemente, il design delle linee cellulari reporter EMT, come l'adenocarcinoma polmonare A549-vimentina-RFP, ha permesso di monitorare la trasformazione delle cellule epiteliali in cellule mesenchimali in tempo reale attraverso l'espressione di vimentina taggata da proteine fluorescenti rosse (RFP). Questa piattaforma potrebbe essere utilizzata per lo screening dei farmaci e lo sviluppo di nuovifarmaci 46. Il colorante LifeAct, un peptide 17-amminoacido, in grado di macchiare le strutture F-actina nelle cellule viventi, sta diventando uno strumento prezioso per visualizzare l'actina citoscheletro in tempo reale senza interferire con i processi cellulari47. In questo studio, abbiamo usato due inibitori a piccole molecole, SB431542 e GW788388, per convalidare il loro effetto inibitorio sulla segnalazione TGF-β e sull'EMT indotto da TGF-β. In particolare, GW788388 inibisce potentemente l'attività di TβRI e TβRII, mentre SB431542 ha un effetto inibitorio solo su TβRI (e ALK4 e ALK7). Studi precedenti hanno rivelato che GW788388 è più potente in vivo di SB43154240. Oltre all'inibizione dell'EMT, GW788388 ha ridotto l'espressione dei marcatori di fibrosi nel rene e la somministrazione orale di GW788388 nei topi diabetici ha notevolmente diminuito la glomerulopatia25,48.
L'EMT svolge un ruolo essenziale nella promozione della plasticità delle cellule tumorali e si traduce nella resistenza ai farmaci e nella metastasi 49. Pertanto, il targeting di cellule derivate dall'EMT con specifici farmaci citotossici50 o l'indurzione della ridifferenziazione tramite transizione mesenchimale-epiteliale (MET)51 è stato proposto come approccio per superare la metastasi delle cellule tumorali e la resistenza alla terapia. Tuttavia, il MET contribuisce alla proliferazione delle cellule tumorali diffuse negli organidistanti 52, che potrebbero essere controproducenti quando si utilizza la reversione terapeutica dell'EMT. Recentemente, un nuovo studio ha riportato un approccio terapeutico di transdifferenziazione prendendo di mira direttamente le cellule tumorali del seno derivate dall'EMT per la differenziazione in adipociti30. Lo studio di Ishay-Ronen et. al.30 ha usato cellule tumorali epiteliali murine Py2T che avevano subito una transizione verso cellule mesenchimali in risposta al trattamento a lungo termine con TGF-β. Hanno dimostrato che la rosiglitazone in combinazione con gli inibitori del MEK ha migliorato la differenziazione epiteliale e l'adipogenesi. Tuttavia, abbiamo scoperto che rosiglitazone da solo era sufficiente per indurre la trasifferentiazione delle cellule murine Py2T mesenchimali in adipociti.
In sintesi, i metodi utilizzati in questo studio hanno fornito un flusso di lavoro logico per indagare la segnalazione di TGF-β e l'EMT indotto β TGF-β. I due inibitori, SB431542 e GW788388, possono bloccare le risposte indotte β TGF e l'EMT. Inoltre, abbiamo anche dimostrato che rosiglitazone da solo induce adipogenesi in alcune cellule tumorali mammari mesenchimali indotte da TGF-β indotti. Sebbene abbiamo usato solo diverse linee cellulari per il cancro al seno per indagare le risposte del TGF-β, i metodi qui descritti potrebbero essere estrapolati ad altre cellule (tumorali). Qui, abbiamo usato varie concentrazioni di TGF-β per indurre risposte cellulari. Nella maggior parte dei tipi di cellule, il TGF-β esercita la sua attività biologica nell'intervallo di concentrazione di 0,01-10 ng/mL53 e induce la segnalazione in un modello dose-risposta. Nelle cellule endoteliali primarie, comprese le cellule endoteliali aortiche bovine, il TGF-β ha indotto la sostanziale espressione di SMAD2 fosforilato a 0,025 ng/mL, ha raggiunto un massimo di 0,25 ng/mL ed è rimasto a questo livello in risposta aconcentrazioni più elevate 53. Nel nostro studio, abbiamo usato un'alta concentrazione di TGF-β (5 ng / mL) nelle cellule MCF10A-Ras per il saggio del reporter trascrizionale per ottenere risposte forti. La fosforilazione SMAD2 e l'espressione genica bersaglio possono essere indotte da TGF-β a bassa dose; pertanto, abbiamo usato 2,5 ng/mL TGF-β per trattare le cellule. Tuttavia, la concentrazione di lavoro più adatta dipende dal tipo di cella e dagli effetti stimati. Per determinare la migliore concentrazione di TGF-β, si consiglia di trattare le cellule con dosi diverse (da basse a alte).

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61830/studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal">Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>.&#160;NMuMG was mislabeled as&#160;cancer cells.
NMuMG cells are non-transformed epithelial breast cells established from a mouse mammary gland. NMuMG cells are frequently used as a model system to investigate TGF-&#946;-induced epithelial to mesenchymal transition (EMT). EMT is induced by TGF-&#946; in premalignant human MCF 10A-RAS (M2) cells and mouse MMTV-PyMT breast cancer cell line. The article has been updated to reflect this.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61830/studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal">Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>.&#160;NMuMG was mislabeled as&#160;cancer cells.

Erratum: Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

La citochina che trasforma il fattore di crescita-β (TGF-β) è il prototipo di un grande gruppo di polipeptidi regolatori strutturalmente e funzionalmente correlati tra cui TGF-βs (cioè TGF-β1, -β2 e -β3), proteine morfogeniche ossee (BMP) e attività1,2. Queste citochine svolgono tutte ruoli importanti nello sviluppo embrionale e nel mantenimento dell'omeostasi dei tessuti e degli organi3. L'errata regolamentazione del TGF-β può portare a una grande varietà di malattie, tra cui ilcancro 4,5. Il TGF-β svolge un ruolo complesso e duale nella progressione del cancro: nelle cellule epiteliali normali e premalignanti, il TGF-β si comporta come un soppressore del tumore inibendo la proliferazione e inducendo apoptosi6,7; tuttavia, nella fase avanzata della progressione tumorale, quando le risposte citostatiche sono bloccate dall'attivazione di oncogeni o dalla perdita di geni soppressori del tumore, TGF-β agisce come potenziatore tumorale promuovendo la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) nelle cellule tumorali, consentendo così l'invasione e la metastasi delle cellule tumorali, agendo sulle cellule nel microambiente tumorale e stimolando l'angiogenesi e l'evasioneimmunitaria 8,9,10.
Il TGF-β è secreto come una molecola precursore inattiva contenente il TGF-β carbossi-terminale maturo e il peptide associato alla latenza (LAP)11. Questo piccolo complesso può essere legato covalentemente da una proteina latente TGF-β-legante (LTBP)12. Il rilascio di TGF-β maturo può essere mediato dall'azione di proteasi specifiche che scindono LAP o dalla trazione meccanica di LAP in un processo dipendente dall'integrina13,14. Oltre alla LTBP, la glicoproteina A ripetizioni predominanti (GARP) è altamente espressa sulla superficie delle cellule T regolatorie (Tregs) e svolge un ruolo simile a LTBP nella regolazione dell'attivazione di TGF-β15,16. GARP si lega direttamente al TGF-β attraverso il legame disolfuro e l'associazione non covalente. L'attivazione di TGF-β dal complesso GARP/TGF-β richiede integrine17. Il TGF-β maturo si lega ai recettori TGF-β serina/treonina chinasi, cioè TGF-β tipo I (TβRI) e TGF-β recettori di tipo II (TβRII)18 per avviare la segnalazione. Il legame del TGF-β a TβRII promuove il reclutamento di TβRI e la formazione di un complesso eteromerico. Successivamente, il TβRI viene fosforilato dalla TβRII chinasi su residui di serina e treonina in un breve motivo ricco di glicina e serina (GS), con conseguente attivazione19,20. Al momento dell'attivazione, tβRI attivato recluta e fosforilati i suoi substrati: i due SMAD specifici del recettore (R-SMAD) che includono SMAD2 e SMAD3 (Figura 1). Gli R-SMAD condividono una struttura complessiva simile con due cosiddetti domini di omologia mad, MH1 e MH2, separati da una regione di linker ricca di proline (Figura 2). Il motivo di legame del DNA all'interno del dominio MH1 di SMAD3 non è conservato tra SMAD2 e SMAD3, e SMAD2 non può legare direttamente il DNA a causa di due inserimenti nel suo dominio MH1 (esone 3 e L1). SMAD2 e SMAD3 possono essere attivati dalla fosforilazione del motivo SSXS nei loro C-termini (Figura 2). L'SMAD2/3 fosforilato forma complessi eteromerici con un comune mediatore SMAD, SMAD4, che si trasferisce nel nucleo per modulare la trascrizione dei geni bersaglio (Figura 1)7,21. Questa via di segnalazione SMAD canonica è regolata con precisione e genera risposte cellulari e tissutali specifiche come la regolazione del destino cellulare e della metastasi delle cellule tumoralie l'invasione 22. Oltre alla segnalazione TGF-β-SMAD, le vie di segnalazione non SMAD possono anche essere attivate direttamente dai recettori per regolare le risposte cellulari avalle 23.
Durante la progressione tumorale, sono necessarie l'attivazione di percorsi SMAD-dipendenti da TGF-β e indipendenti da SMAD per l'induzione dell'EMT. L'EMT è un processo reversibile in cui le cellule tumorali disferenziano da un fenotipo epiteliale, che è associato alla perdita di contatti cellulare-cellula e alla diminuzione della polarità apicale-basale, a un fenotipo mesenchimale con maggiore motilità e capacità di invasione24. L'EMT è caratterizzato da una maggiore espressione delle proteine marcatori mesenchimali, tra cui N-cadherina, vimentina, Zeb2 e Lumaca1/2, e dalla concomitante downregolazione dei marcatori epiteliali, come E-cadherina e β-catenina (Figura 3)25. Tuttavia, la transizione da uno stato epiteliale a uno mesenchimale è spesso incompleta, e le cellule acquisiscono caratteristiche epiteliali e mesenchimali miste (E/M). Un recente documento dell'associazione internazionale EMT ha proposto di descrivere il processo delle cellule sottoposte a stati fenotipici intermedi E/M come plasticità epiteliale-mesenchimale (EMP)26. Questa plasticità si riferisce a EMT parziale, uno stato E/M ibrido, uno stato EMT metastabile, un continuum EMT e uno spettro EMT26. Durante l'EMT, le cellule tumorali acquisiscono proprietà delle cellule staminali tumorali (CSC) e diventano più resistenti all'apoptosi indotta daldistacco 27. Mentre l'EMT è responsabile dell'acquisizione di un fenotipo invasivo nelle cellule tumorali primarie e guida la progressione del cancro, al contrario, la transizione mesenchimale-epiteliale (MET) ha dimostrato di svolgere un ruolo importante nella crescita delle cellule tumorali diffuse in siti metastaticidistanti 28,29. Un recente studio ha dimostrato che le cellule tumorali del seno derivate dall'EMT possono essere trasifferenti in adipociti, il che potrebbe offrire l'opportunità di inibire la metastasi e superare la resistenza alla terapia nelle cellule tumorali e il cancro ricaduto30. A causa dell'importante ruolo del TGF-β segnalazione nell'attivazione dell'EMT nella carcinogenesi mammario, presentiamo protocolli dettagliati per l'assorbimento occidentale, un saggio di reporter trascrizionale luciferasi, reazione quantitativa a catena in tempo reale-polimerasi (qRT-PCR) e immunofluorescenza per lo studio della segnalazione TGF-β, EMT indotto da TGF-β e la trasifferentiazione delle cellule tumorali epiteliali del seno murino derivate dall'EMT in adipociti. Queste tecniche sono gli strumenti analitici più comunemente usati nel campo della biologia cellulare. qRT-PCR viene utilizzato per rilevare, caratterizzare e quantificare i livelli di espressione dell'mRNA in modo quantitativo. Rispetto alla PCR quantitativa (qPCR), una tecnica alternativa, la trascrizione inversa (RT)-PCR può essere utilizzata per determinare l'espressione dell'mRNA in modo semi-quantitativo31,32. L'assorbimento occidentale viene utilizzato per esaminare specifici livelli proteici in un dato campione di lisato cellulare con vantaggi di sensibilità e specificità, in modo semi-quantitativo. Pertanto, presentiamo un flusso di lavoro sistematico per analizzare i cambiamenti dall'espressione genica all'espressione proteica per aiutare a indagare la segnalazione TGF-β che può essere applicata anche ad altre vie di segnalazione.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm-side square glass coverslips</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>631-1331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-E-cadherin antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) antibody</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-N-cadherin antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Slug antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SMAD2/3 antibody</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>610842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Snail antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tubulin antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera enterotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1705060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-high glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-high glucose medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11039047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>01-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S1860-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq qPCR Master Mix</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>A600X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>91077C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA II kit</td>
			<td>BIOKE&#180;</td>
			<td>740955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (Pen-Strep)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K1621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skimmed milk</td>
			<td>Campina: Elk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>17001402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>2030-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying tgf-&#946; signaling and tgf-&#946;-induced epithelial-to-mesenchymal transition in breast cancer and normal cells

Trasformare il fattore di β (TGF-β) è un fattore multifunzionale secreto che svolge un ruolo chiave nella comunicazione intercellulare. Le perturbazioni del segnale TGF-β possono portare al cancro al seno. TGF-β provoca i suoi effetti sulla proliferazione e differenziazione attraverso specifici recettori della superficie cellulare TGF-β di tipo I e di tipo II (cioè TβRI e TβRII) che contengono un dominio intrinseco serina/treonina chinasi. Dopo la formazione complessa eteromerica indotta da TGF-β, il TβRI attivato provoca la segnalazione intracellulare fosforilando SMAD2 e SMAD3. Questi SMAD attivati formano complessi eteromerici con SMAD4 per regolare specifici geni bersaglio, incluso l'inibitore dell'attivazione del plasminogeno 1 (PAI-1, codificato dal gene SERPINE1). L'induzione della transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) consente alle cellule tumorali epiteliali nel sito primario o durante la colonizzazione in siti lontani di ottenere un fenotipo invasivo e guidare la progressione tumorale. TGF-β agisce come un potente induttore dell'invasione del cancro al seno guidando l'EMT. Qui descriviamo metodi sistematici per indagare la segnalazione TGF-β e le risposte EMT utilizzando cellule MCF10A-RAS (M2) umane premalignanti e cellule epiteliali NMuMG del topo come esempi. Descriviamo metodi per determinare la fosforilazione SMAD2 indotta da TGF-β mediante soffiatura occidentale, attività trascrizionale dipendente da SMAD3/SMAD4 utilizzando l'attività del reporter luciferasi e l'espressione genica bersaglio SERPINE1 mediante reazione quantitativa a catena in tempo reale-polimerasi (qRT-PCR). Inoltre, vengono descritti metodi per esaminare l'EMT indotta da TGF-β misurando i cambiamenti nella morfologia, nell'espressione del marcatore epiteliale e mesenchimale, nella colorazione dell'actina filamentosa e nella colorazione dell'immunofluorescenza dell'E-cadherina. Due inibitori selettivi della chinasi del recettore TGF-β a piccola molecola, GW788388 e SB431542, sono stati utilizzati per bloccare la fosforilazione SMAD2 indotta da TGF-β, geni bersaglio e cambiamenti nell'espressione marcatore EMT. Inoltre, descriviamo la transdifferenziazione delle cellule tumorali epiteliali murine Py2T del seno mesenchimale in adipociti. I metodi per esaminare la segnalazione indotta β TGF e l'EMT nel cancro al seno possono contribuire a nuovi approcci terapeutici per il cancro al seno.

Analisi della segnalazione TGF-β Il passo chiave nella segnalazione TGF-β è la fosforilazione dei due residui di serina terminale più carbossici nel motivo SSXS (Figura 2) di TβRI chinasi38,39. Per indagare sulle risposte di segnalazione β TGF-β, abbiamo eseguito gonfiore occidentale di SMAD2 fosforilato. Nelle cellule MCF10A-Ras del seno umano premalignant, la fosforilazione di SMAD2 è aumentata significativamente in risposta alla stimolazione del TGF-β per 1 ora, mentre l'espressione dell'SMAD2/3 totale non è stata influenzata dal trattamento TGF-β (Figura 4A). Utilizzando il saggio di reporter trascrizionale CAGA-luc indotto da TGF-β/4, abbiamo scoperto che TGF-β ha notevolmente indotto il reporter luciferasi nella linea di cellule MCF10A-Ras rispetto alle cellule non trattate (Figura 4B). Inoltre, abbiamo osservato che obiettivi genico trascrizionale diretti ben caratterizzati di TGF-β tra cui SMAD7 e SERPINE1 (codifica per la proteina PAI-1), erano altamente espressi nelle cellule MCF10A-Ras trattate con TGF-β(Figura 4C).
Analisi dell'EMT indotto β TGF La Corte ha valutato l'EMT indotto da TGF-β con vari metodi, come i cambiamenti morfologici, l'espressione dei marcatori EMT a livello di mRNA e proteine e la colorazione immunofluorescenza dei marcatori EMT36. Le cellule epiteliali NMuMG trattate con TGF-β per 1 e 2 giorni sono cambiate da una morfologia epiteliale classica a una morfologia mesenchimale a forma di mandrino, come mostrato dalla microscopia a contrasto di fase (Figura 5A). Coerentemente con i cambiamenti morfologici, abbiamo osservato che il trattamento TGF-β ha portato ad un aumento dell'espressione proteica dei marcatori mesenchimali, tra cui N-cadherina, Lumaca eLumaca 37 (Figura 5B). Al contrario, l'E-cadherina, un marcatore epiteliale, è stata downregolata nelle cellule NMuMG dopo 2 giorni di trattamento TGF-β(Figura 5B). Inoltre, abbiamo eseguito una reazione quantitativa a catena in tempo reale-polimerasi (qRT-PCR) per indagare l'espressione genica dei marcatori EMT. Il CDH1 (codifica per la proteina E-cadherina) è stato significativamente diminuito, mentre marcatori mesenchimali come SNAIL e Zinc finger E-box-binding homeobox 2 (ZEB2) sono stati notevolmente aumentati dopo la stimolazione TGF-β nelle cellule NMuMG rispetto alle cellule non trattate ( Figura5C). L'EMT indotto β TGF nelle cellule NMuMG è stato ulteriormente confermato dalla colorazione dell'immunofluorescenza dell'E-cadherina. Dopo la stimolazione β TGF per 2 giorni, le cellule NMuMG hanno espresso meno E-cadherina rispetto alle cellule del gruppo di controllo non indotto, come analizzato dalla microscopia confocale (Figura 5D). Inoltre, le cellule NMuMG in presenza di TGF-β formato più fibre di stress da actina, come mostrato dalla microscopia confocale (Figura 5E).
SB431542 e GW788388 inibiscono la segnalazione TGF-β e l'EMT indotto β TGF SB431542 è un inibitore competitivo atp del dominio della chinasi del TβRI, mentre la chinasi 5 (ALK5), chiamata anche recettore dell'attivina, mentre GW788388 inibisce l'attività della TβRI e della TβRII chinasi. Entrambi gli inibitori possono inibire la segnalazione del recettore βTGF-β 40. Pertanto, abbiamo trattato cellule NMuMG con diverse concentrazioni di GW788388 in presenza di TGF-β per 1 ora. Come previsto, GW788388 ha inibito la fosforilazione SMAD2 indotta da TGF-β in modo dose-dipendente (Figura 6A). Inoltre, la fosforilazione β TGF-mediata di SMAD2 è stata bloccata dal trattamento SB431542 (Figura 6A). L'SMAD2/3 fosforilato forma un complesso eteromerico con SMAD4 e si trasferisce nel nucleo per modulare la trascrizione dei geni bersaglio. Pertanto, abbiamo studiato la traslocazione di SMAD2/3 nelle cellule NMuMG mediante colorazione ad immunofluorescenza di SMAD2/3. I dati hanno dimostrato che sia SB431542 che GW788388 hanno inibito significativamente la traslocazione nucleare indotta da TGF-β e l'accumulo di SMAD2/3 nelle cellule NMuMG (Figura 6B). Inoltre, gli effetti inibitori di SB431542 e GW788388 sono stati osservati anche nei livelli di espressione dell'mRNA di importanti geni bersaglio TGF-β coinvolti nell'EMT, tra cui PAI-1, LUMACA, E-cadherina e fibronectina (Figura 6C). Questi dati suggerirono che SB431542 e GW788388 bloccarono la segnalazione TGF-β e l'EMT indotto β TGF.
Analisi della transdifferenziazione delle cellule del cancro al seno mesenchimale in adipociti L'EMT svolge un ruolo vitale nel migliorare la plasticità cellulare nei tumori e si traduce nello sviluppo della resistenza alla terapia. La plasticità delle cellule tumorali può essere direttamente mirata e inibita con un approccio di trans-differenziazione, come l'adipogenesiforzata 30. Abbiamo usato cellule tumorali del seno murino Py2T, che derivavano dalla ghiandola mammaria di un topo virus tumorale mammario-polioma medio tumorale-antigene (MMTV-PyMT) transgenico, come modello cellulare di plasticità delle cellule tumorali indotta da EMT. Sulla base di un protocollostabilito 41, abbiamo trattato le cellule tumorali del seno murino Py2T derivate da EMT con il farmaco antidiabetico rosiglitazone per 10 giorni per indurre l'adipogenesi. L'adipogenesi è stata valutata visualizzando le goccioline lipidiche utilizzando la colorazione O rosso olio. Le cellule adipose sono state prontamente rilevate nelle cellule tumorali del seno murino Py2T trattate con rosiglitazone (Figura 7), che hanno dimostrato che il trattamento con rosiglitazone da solo è sufficiente a promuovere la trasifferentiazione delle cellule tumorali del seno derivate dall'EMT in adipociti.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig01.jpg"> Figura 1: Segnalazione TGF-β/SMAD. La segnalazione del TGF-β inizia con il legame del TGF-β al recettore TGF-β di tipo II (TβRII), una chinasi costitutivamente attiva, che fosforilati TGF-β recettore di tipo I (TβRI). Quindi, attivata la TβRI chinasi fosforilati SMAD2/3. Un peptide contenente il motivo SSXS di SMAD2 con due residui di serina fosforilata terminale carbossidica è stato utilizzato per ottenere antisieri policlonali che riconoscono il fosforo-SMAD2 (p-SMAD2). Pertanto, l'analisi dell'espressione p-SMAD2 da parte della macchia occidentale può essere utilizzata per determinare l'attivazione della via di segnalazione TGF-β di segnalazione. L'SMAD2/3 fosforilato può formare complessi eteromerici con SMAD4, che poi si trasferiscono nel nucleo per modulare le risposte trascrittive. Il saggio reporter CAGA12-luciferasi e il PCR quantitativo in tempo reale (qRT-PCR) per l'espressione dell'mRNA dei geni bersaglio TGF-β come SMAD7 e SERPINE1 (codifica della proteina PAI-1), possono essere utilizzati per analizzare le risposte trascritte SMAD3 indotte da TGF-β. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig02.jpg"> Figura 2: Struttura schematica degli R-SMAD (SMAD2 e SMAD3). I domini MH1 (blu) e MH2 (giallo) sono conservati tra gli R-SMAD, ma l'area del linker (grigio) non è conservata. Il dominio MH1 di SMAD3 ospita un motivo legante il DNA, mentre SMAD2 non può legare direttamente il DNA, a causa di un inserimento (esone 3) nel suo dominio MH1. Il dominio MH2 media l'oligomerizzazione SMAD, l'interazione con i recettori TGF-β e il legame proteico ed è coinvolto nella regolazione trascrizionale. SMAD2 e SMAD3 possono essere attivati dalla fosforilazione del motivo SSXS (in rosso) nei loro termini C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig03.jpg"> Figura 3: EMT indotto β TGF. Durante la transizione epiteliale-mesenchimale indotta da TGF-β (EMT), le cellule subiscono la perdita epiteliale e l'acquisizione di caratteristiche mesenchimali con una maggiore motilità cellulare e capacità di invasione. L'induzione dell'EMT porta all'espressione di marcatori mesenchimali come N-cadherina, Zeb2 e Lumaca1/2, così come alla downregolazione di marcatori epiteliali tra cui E-cadherina, β-catenina e claudina-1. La perdita o il guadagno accumulato di caratteristiche epiteliali/mesenchimali (E/M) fa sì che una cellula entri negli stati intermedi in modo reversibile. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig04.jpg"> Figura 4: Risposte di segnalazione β TGF-β nelle cellule MCF10A-Ras. (A) Le cellule MCF10A-Ras sono state trattate con o senza TGF-β (2,5 ng/mL) per 1 ora e i liti cellulari sono stati immunoblottati per SMAD2 fosforilato (p-SMAD2), SMAD2/3 totale e GAPDH (come controllo del carico). Il marcatore di dimensione è mostrato a destra. Contro: Gruppo di controllo senza TGF-β trattamento. (B) Analisi dell'attività TGF-β (5 ng/mL) utilizzando il reporter trascrizionale CAGA12-luciferasi (LUC) dipendente da SMAD3-SMAD4 nelle cellule MCF10A-Ras. I valori sono normalizzati in β-galattosidasi (βGal). I dati sono espressi come media ± s.d, n = 3. Test t dello studente, ***P ≤ 0.001 (C) qRT-PCR analisi dei geni bersaglio TGF-β SMAD7 e SERPINE1 (codifica per la proteina PAI-1) nelle cellule MCF10A-Ras trattate con TGF-β (2,5 ng/mL) per 6 ore. GAPDH è stato utilizzato come controllo interno. I dati sono espressi come media ± s.d, n = 3. Test t dello studente, ***P ≤ 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig05.jpg"> Figura 5: EMT indotto β TGF nelle cellule NMuMG. (A) Morfologia delle cellule NMuMG trattate con TGF-β (2,5 ng/mL) per 1 o 2 giorni. In presenza di cellule TGF-β, le cellule NMuMG si sono trasferenziate in un fenotipo mesenchimale. Barra di scala = 150 μm (B) Le cellule NMuMG sono state trattate con o senza TGF-β (5 ng/mL) per 2 giorni, e i marcatori EMT sono stati analizzati dal western blotting. Il marcatore di dimensione è come indicato a destra. Contro: Gruppo di controllo senza TGF-β trattamento. (C) Analisi dell'espressione genica dei marcatori EMT (CDH1 (codifica per la proteina E-cadherina),LUMACA e ZEB2) nelle cellule NMuMG trattate per 2 giorni con TGF-β (5 ng/mL). GAPDH è stato utilizzato come controllo interno. I risultati sono espressi come la media ± s.d., n = 3. Test t dello studente, *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001. (D) Le cellule NMuMG sono state macchiate dall'immunofluorescenza per rilevare l'espressione del marcatore epiteliale E-cadherina (rosso) dopo il trattamento TGF-β (2,5 ng/mL) per 2 giorni. I nuclei erano controsostenibili con DAPI (blu). Le immagini sono state catturate con microscopia confocale. La barra di scala = 50 μm(E) cellule NMuMG erano macchiate di fluoresceina-phalloidina (verde) per visualizzare f-actina. I nuclei erano controsostenibili con DAPI (blu). Barra di scala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig06.jpg"> Figura 6: TGF-βsignaling e TGF-β-induced EMT sono stati inibiti da SB431542 e GW788388. (A) Le cellule NMuMG sono state trattate con 10 μM di SB431542 (SB) o le concentrazioni indicate di GW788388 (GW) in presenza o assenza di TGF-β (5 ng/mL) per 1 ora. I llysati cellulari sono stati immunoblotted per p-SMAD2, SMAD2/3 e GAPDH. (B) Le cellule NMuMG sono state trattate con 5 μM di SB431542 (SB) o 10 μM di GW788388 (GW) in presenza o assenza di 5 ng/mL di TGF-β per 1 ora e macchiate da immunofluorescenza per rilevare la traslocazione nucleare di SMAD2/3 (verde). Le immagini sono state catturate con microscopia confocale. (C) L'espressione dei geni bersaglio TGF-β, tra cui PAI-1 e i geni che codificano marcatori EMT, tra cui LUMACA, E-Cadherina e Fibronectina, sono stati analizzati mediante reazione a catena della transcriptasi polimerasi inversa (RT-PCR) nelle cellule NMuMG dopo il trattamento SB o GW e stimolazione TGF-β per 48 ore. GAPDH fungeva da controllo di carico. Il controllo indica le celle non trattate. Questa cifra è stata modificata da Petersen M. et al. 34 con il permesso dell'editore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig07.jpg"> Figura 7: Le cellule tumorali del seno murino Py2T derivate dall'EMT possono essere indotte a differenziarsi in adipociti. Le cellule tumorali del seno murino Py2T sono state stimolate con 2 ng/ mL TGF-β per 20 giorni per indurre l'EMT completo. Quindi, le cellule sono state trattate con DMSO come controllo del veicolo o rosiglitazone (2 μM) per 10 giorni per consentire la differenziazione delle cellule tumorali mesenchimali e indurre l'adipogenesi. Il mezzo è stato cambiato ogni 2 giorni. Dopo 10 giorni di trattamento, le cellule sono state macchiate con olio rosso O. Barra scala = 50 μm. Fare clic <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig07large.jpg" target="_blank">qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>specie</td>
			<td>Nome genico</td>
			<td colspan="2">Avanti (da 5' a 3')</td>
			<td colspan="2">Rovescio (da 5' a 3')</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Umano</td>
			<td>GAPDH</td>
			<td colspan="2">TGCACCACCAACTGCTTAGC</td>
			<td colspan="2">GGCATGGACTGTGGTCATGAG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SMAD7</td>
			<td colspan="2">TCCAGATGCTGTGCCTTCC</td>
			<td colspan="2">GTCCGAATTGAGCTGTCCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SERPINA1</td>
			<td colspan="2">CACAAATCAGACGGCAGCACT</td>
			<td colspan="2">CATCGGGCGTGGTGAACTC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">topo</td>
			<td>GAPDH</td>
			<td colspan="2">TGGCAAAGTGGAGATTGTTGCC</td>
			<td colspan="2">AAGATGGTGATGGGCTTCCCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cdh1</td>
			<td colspan="2">ACCAAAGTGACGCTGAAGTC</td>
			<td colspan="2">GAGGATGTACTTGGCAATGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>lumaca</td>
			<td colspan="2">CAGCTGGCCAGGCTCGGT</td>
			<td colspan="2">GCGAGGGCCTCCGGAGCA</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZEB2</td>
			<td colspan="2">TTCTGCAAGCCTCTGTAGCC</td>
			<td colspan="2">TTCTGGCCCCATTGCATCAT</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Primer utilizzati per qRT-PCR.

Watch this Scientific Journal Video about Studying TGF-ÃŽÂ² Signaling and TGF-ÃŽÂ²-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells at JoVE.com

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Descriviamo un flusso di lavoro sistematico per indagare la segnalazione di TGF-β e l'EMT indotto da TGF-β studiando l'espressione proteica e genica coinvolta in questa via di segnalazione. I metodi includono western blotting, un saggio di reporter luciferasi, qPCR e colorazione immunofluorescenza.

Studio della segnalazione β TGF e della transizione epiteliale-mesenchimale indotta da TGF-β nel cancro al seno e nelle cellule normali

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...

studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal

Research

JoVE Journal

Cancer Research

12.4K Views.  Leiden University Medical Center. Descriviamo un flusso di lavoro sistematico per indagare la segnalazione di TGF-β e l'EMT indotto da TGF-β studiando l'espressione proteica e genica coinvolta in questa via di segnalazione. I metodi includono western blotting, un saggio di reporter luciferasi, qPCR e colorazione immunofluorescenza.

Video: Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery of the next generation of novel drug targets. It is becoming apparent that more complex models of cancer are required to fully appreciate the contributing factors that drive tumorigenesis in vivo and increase the efficacy of novel therapies that make the transition from pre-clinical models to clinical trials.
Here we present a methodology for generating uniform and reproducible tumor spheroids that can be subjected to siRNA functional screening. These spheroids display many characteristics that are found in solid tumors that are not present in traditional two-dimension culture. We show that several commonly used breast cancer cell lines are amenable to this protocol. Furthermore, we provide proof-of-principle data utilizing the breast cancer cell line BT474, confirming their dependency on amplification of the epidermal growth factor receptor HER2 and mutation of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) when grown as tumor spheroids. Finally, we are able to further investigate and confirm the spatial impact of these dependencies using immunohistochemistry.

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

Utilizzando Genomica Funzionale screening per identificare gli obiettivi farmaco potenzialmente romanzo in Cancer Cell Culture Spheroid

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Synthesis and Characterization of an Aspirin-fumarate Prodrug that Inhibits NF&#954;B Activity and Breast Cancer Stem Cells

Inflammation is a cancer hallmark that underlies cancer incidence and promotion, and eventually progression to metastasis. Therefore, adding an anti-inflammatory drug to standard cancer regiments may improve patient outcome. One such drug, aspirin (acetylsalicylic acid, ASA), has been explored for cancer chemoprevention and anti-tumor activity. Besides inhibiting the cyclooxygenase 2-prostaglandin axis, ASA&#39;s anti-cancer activities have also been attributed to nuclear factor &#312;B (NF&#312;B) inhibition. Because prolonged ASA use may cause gastrointestinal toxicity, a prodrug strategy has been implemented successfully. In this prodrug design the carboxylic acid of ASA is masked and additional pharmacophores are incorporated.
This protocol describes how we synthesized an aspirin-fumarate prodrug, GTCpFE, and characterized its inhibition of the NF&#312;B pathway in breast cancer cells and attenuation of the cancer stem-like properties, an important NF&#312;B-dependent phenotype. GTCpFE effectively inhibits the NF&#312;B pathway in breast cancer cell lines whereas ASA lacks any inhibitory activity, indicating that adding fumarate to ASA structure significantly contributes to its activity. In addition, GTCpFE shows significant anti-cancer stem cell activity by blocking mammosphere formation and attenuating the cancer stem cell associated CD44+CD24- immunophenotype. These results establish a viable strategy to develop improved anti-inflammatory drugs for chemoprevention and cancer therapy.

Synthesis and Characterization of an Aspirin-fumarate Prodrug that Inhibits NF&amp;#954;B Activity and Breast Cancer Stem Cells

This procedure will demonstrate how we synthesized and characterized the anti-NF&#954;B and anti-cancer stem cell activity of an aspirin-fumarate prodrug.

Sintesi e caratterizzazione di un profarmaco Aspirina-fumarato che inibisce NFκB attività e della mammella cellule tumorali staminali

Inflammation is a cancer hallmark that underlies cancer incidence and promotion, and eventually progression to metastasis. Therefore, adding an ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying cancer metastasis in vivo, other efficient, reliable, low-cost models are needed to quickly access the potential effects of (epi)genetic changes or pharmacological compounds. As such, we illustrate and explain the feasibility of xenograft models using human breast cancer cells injected into zebrafish embryos to support this goal. Under the microscope, fluorescent proteins or chemically labeled human breast cancer cells are transplanted into transgenic zebrafish embryos, Tg (fli:EGFP), at the perivitelline space or duct of Cuvier (Doc) 48 h after fertilization. Shortly afterwards, the temporal-spatial process of cancer cell invasion, dissemination, and metastasis in the living fish body is visualized under a fluorescent microscope. The models using different injection sites, i.e., perivitelline space or Doc are complementary to one another, reflecting the early stage (intravasation step) and late stage (extravasation step) of the multistep metastatic cascade of events. Moreover, peritumoral and intratumoral angiogenesis can be observed with the injection into the perivitelline space. The entire experimental period is no more than 8 days. These two models combine cell labeling, micro-transplantation, and fluorescence imaging techniques, enabling the rapid evaluation of cancer metastasis in response to genetic and pharmacological manipulations.

Here, we describe xenograft zebrafish models using two different injection sites, i.e., perivitelline space and duct of Cuvier, to investigate the invasive behavior and to assess the intravasation and extravasation potential of human breast cancer cells, respectively.

Invasiva comportamento delle cellule cancro al seno umano in Zebrafish embrionali

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In particular, endothelial cells (EC) constituting the inner surface of vessels, directly participate in oxygen delivery, nutrient supply, and removal of waste products to and from tumors, and are thereby prominently involved in the constitution of the tumor microenvironment (TME). Tumor endothelial cells (TECs) can be used as cellular biosensors of the intratumoral microenvironment established by communication between tumor and stromal cells. TECs also serve as targets of therapy. Accordingly, in culture these cells allow studies on mechanisms of response or resistance to anti-angiogenic treatment. Recently, it was found that TECs isolated from human colorectal carcinoma (CRC) exhibit memory-like effects based on the specific TME they were derived from. Moreover, these TECs actively contribute to the establishment of a specific TME by the secretion of different factors. For example, TECs in a prognostically favorable Th1-TME secrete the anti-angiogenic tumor-suppressive factor secreted protein, acidic and rich in cysteine-like 1 (SPARCL1). SPARCL1 regulates vessel homeostasis and inhibits tumor cell proliferation and migration. Hence, cultures of pure, viable TECs isolated from human solid tumors are a valuable tool for functional studies on the role of the vascular system in tumorigenesis. Here, a new up-to-date protocol for the isolation of primary EC from the normal colon as well as CRC is described. The technique is based on mechanical and enzymatic tissue digestion, immunolabeling, and fluorescence activated cell sorting (FACS)-sorting of triple-positive cells (CD31, VE-cadherin, CD105). With this protocol, viable TEC or normal endothelial cell (NEC) cultures could be isolated from colon tissues with a success rate of 62.12% when subjected to FACS-sorting (41 pure EC cultures from 66 tissue samples). Accordingly, this protocol provides a robust approach to isolate human EC cultures from normal colon and CRC.

Tumor endothelial cells are important determinants of the tumor microenvironment and the course of the disease. Here, a protocol for the isolation of pure and viable endothelial cells from human colorectal carcinoma and normal colon to be used in drug testing and pathogenesis research is described.

Isolamento di cellule endoteliali umane da Colon normale e Carcinoma colorettale - un protocollo migliorato

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue and its role in local recurrence at the primary tumor site are unknown. Here we present a method for the decellularization, lyophilization, and fabrication of ECM hydrogels derived from murine mammary fat pads. Results are presented on the effectiveness of the decellularization process, and rheological parameters were assessed. GFP- and luciferase-labeled breast cancer cells encapsulated in the hydrogels demonstrated an increase in proliferation in irradiated hydrogels. Finally, phalloidin conjugate staining was employed to visualize cytoskeleton organization of encapsulated tumor cells. Our goal is to present a method for fabricating hydrogels for in vitro study that mimic the in vivo breast tissue environment and its response to radiation in order to study tumor cell behavior.

This protocol presents a method for decellularization and subsequent hydrogel formation of murine mammary fat pads following ex vivo irradiation.

Studiare i normali effetti di radiazione dei tessuti utilizzando idrogel a matrice extracellulare

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and recurrent disease. This population can be identified by surface markers, enzymatic activity and a functional profile. These approaches per se are limited, due to phenotypic heterogeneity and CSC plasticity. Here, we update the sphere-forming protocol to obtain CSC spheres from breast and gynecological cancers, assessing functional properties, CSC markers and protein expression. The spheres are obtained with single-cell seeding at low density in suspension culture, using a semi-solid methylcellulose medium to avoid migration and aggregates. This profitable protocol can be used in cancer cell lines but also in primary tumors. The tridimensional non-adherent suspension culture thought to mimic the tumor microenvironment, particularly the CSC-niche, is supplemented with epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor to ensure CSC signaling. Aiming for robust identification of CSC, we propose a complementary approach, combining functional and phenotypic evaluation. Sphere-forming capacity, self-renewal and sphere projection area establish CSC functional properties. Additionally, characterization comprises flow cytometry evaluation of the markers, represented by CD44+/CD24- and CD133, and Western blot, considering ALDH. The presented protocol was also optimized for primary tumor samples, following a sample digestion procedure, useful for translational research.

The aim of this methodology is to identify cancer stem cells (CSC) in cancer cell lines and primary human tumor samples with the sphere-forming protocol, in a robust manner, using functional assays and phenotypic characterization with flow cytometry and Western blot.

Ottenere le sfere delle cellule staminali tumorali da tumori ginecologici e tumori del cancro

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction of differentiation of two mouse breast epithelial cell lines, HC11 and EpH4, and their use to study complementary stages of mammary gland development and neoplastic transformation.
The HC11 mouse breast epithelial cell line originated from the mammary gland of a pregnant Balb/c mouse. It differentiates when grown to confluence attached to a plastic Petri dish surface in medium containing fetal calf serum and Hydrocortisone, Insulin and Prolactin (HIP medium). Under these conditions, HC11 cells produce the milk proteins &#946;-casein and whey acidic protein (WAP), similar to lactating mammary epithelial cells, and form rudimentary mammary gland-like structures termed &#34;domes&#34;.
The EpH4 cell line was derived from spontaneously immortalized mouse mammary gland epithelial cells isolated from a pregnant Balb/c mouse. Unlike HC11, EpH4 cells can fully differentiate into spheroids (also called mammospheres) when cultured under three-dimensional (3D) growth conditions in HIP medium. Cells are trypsinized, suspended in a 20% matrix consisting of a mixture of extracellular matrix proteins produced by Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma cells, plated on top of a layer of concentrated matrix coating a plastic Petri dish or multiwell plate, and covered with a layer of 10% matrix-containing HIP medium. Under these conditions, EpH4 cells form hollow spheroids that exhibit apical-basal polarity, a hollow lumen, and produce &#946;-casein and WAP.
Using these techniques, our results demonstrated that the intensity of the cadherin/Rac signal is critical for the differentiation of HC11 cells. While Rac1 is necessary for differentiation and low levels of activated RacV12 increase differentiation, high RacV12 levels block differentiation while inducing neoplasia. In contrast, EpH4 cells represent an earlier stage in mammary epithelial differentiation, which is inhibited by even low levels of RacV12.

We describe techniques for differentiation induction of two breast epithelial lines, HC11 and EpH4. While both require fetal calf serum, insulin, and prolactin to produce milk proteins, EpH4 cells can fully differentiate into mammospheres in three-dimensional culture. These complementary models are useful for signal transduction studies of differentiation and neoplasia.

Differenziazione delle cellule epiteliali del seno del topo HC11 e EpH4

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less aggressive breast tumors, the 5-year survival rate of TNBC patients is 77% due to their characteristic drug-resistant phenotype and metastatic burden. Toward this end, murine models have been established aimed at identifying novel therapeutic strategies limiting TNBC tumor growth and metastatic spread. This work describes a practical guide for the TNBC orthotopic model where MDA-MB-231 breast cancer cells suspended in a basement membrane matrix are implanted in the fourth mammary fat pad, which closely mimics the cancer cell behavior in humans. Measurement of tumors by caliper, lung metastasis assessment via in vivo and ex vivo imaging, and molecular detection are discussed. This model provides an excellent platform to study therapeutic efficacy and is especially suitable for the study of the interaction between the primary tumor and distal metastatic sites.

This work presets an advanced protocol to accurately assess tumor loading by detection of green fluorescent protein and bioluminescence signals as well as the integration of quantitative molecular detection technique.

Studiare il cancro al seno triplo negativo utilizzando il modello di cancro al seno ortotopico

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. Immortalized cell lines are easy to grow and genetically modify to study molecular mechanisms, yet the selective pressure from cell culture often leads to genetic and epigenetic alterations over time. Patient-derived xenograft (PDX) models faithfully recapitulate the heterogeneity and drug response of human breast tumors. PDX models exhibit a relatively short latency after orthotopic transplantation that facilitates the investigation of breast tumor biology and drug response. The transplantable genetically engineered mouse models allow the study of breast tumor immunity. The current protocol describes the method to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad followed by drug treatments. These preclinical models provide valuable approaches to investigate breast tumor biology, drug response, biomarker discovery and mechanisms of drug resistance.

Patient-derived xenograft (PDX) models and transplantable genetically engineered mouse models faithfully recapitulate human disease and are preferred models for basic and translational breast cancer research. Here, a method is described to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad to study tumor biology and evaluate drug response.

Trapianto ortotopico di tumori al seno come modelli preclinici per il cancro al seno

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

Isolamento e valutazione funzionale di cellule staminali di cancro al seno umano da campioni di cellule e tessuti

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...