אנו מכירים בתמיכת מועצת המלגות הסינית (CSC) ל- J.Z. ולמרכז הגנומיקה לסרטן בהולנד (CGC). NL) לפ.ט.ד.

1. ניתוח של זרחון SMAD2 הנגרמת על ידי TGF-β באמצעות סופג מערבי
הערה: תאי MCF10A-Ras של השד האנושי הפרה-מיניים שימשו כדוגמה לחקירת תגובות איתות TGF-β33. באופן עקרוני, השיטות המתוארות להלן חלות גם על קווי תאים אחרים בעלי תגובה β TGF.
<ol><li>תרבות קו תא אפיתל השד MCF10A-ראס ב 37 °C (77 °F) במדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM)/F12 המכיל L-גלוטמין עם 5% סרום סוס, 20 ng/mL גורם גדילה אפידרמיס (EGF), 10 מ"ג / מ"ל אינסולין, 100 ng / mL כולרה enterotoxin, 0.5 מ"ג / מ"ל הידרוקורטיזון, ו 1:100 פניצילין-סטרפטומיצין (עט-סטרפטוצין).</li>
	<li>טריפסינייז MCF10A-ראס תאים עם 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA במשך 1 דקה ולספור תאים קיימא באמצעות מונה התא.</li>
	<li>תאי זרע לתוך צלחות 6-באר בצפיפות של 5×105 תאים / גם.</li>
	<li>לאחר צמיחה של לילה, לטפל בתאים עם או TGF-β (5 ng/mL) או חיץ ליגנד (4 mM HCl, 0.1% שומן ללא חומצת שומן סרום אלבומין (BSA)) במשך 1 שעה, ולאחר מכן להסיר מדיום תרבות בעדינות לשטוף את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של תמיסת מלח פוספט אגירה (PBS).</li>
	<li>תאים מגניבים בצלחות 6 בארות על קרח ומוסיפים 150 μL של מבחני משקעים חיסוניים רדיו (RIPA) מאגר תמוגה (150 mM NaCl, 0.1% טריטון X-100, 0.5% נתרן deoxycholate, 0.1% SDS, 50 מ"מ Tris-HCl pH 8.0, וקוקטייל מעכב פרוטאז מיני הוסיף טרי). אפשר לתמוגה להמשיך על הקרח במשך 10 דקות.</li>
	<li>לגרד תאים חסידים את המנה באמצעות מגרד תא פלסטיק, ואז בעדינות להעביר את המתלה התא לתוך צינור microcentrifuge precooled.</li>
	<li>צנטריפוגה התא lysate במשך 10 דקות ב 150 כוח צנטריפוגלי (x g) ב 4 מעלות צלזיוס ולהעביר את supernatant לצינור טרי 1.5 מ"ל microcentrifuge.</li>
	<li>למדוד את ריכוז החלבון באמצעות ערכת מבחני חלבון תואמת חומר ניקוי (DC).</li>
	<li>טען 30 מיקרוגרם חלבון מכל דגימה על 10% נתרן דודקיל סולפט פוליאקרילמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) ג'ל ולהפעיל את הג'ל במתח של 100 V במשך 1.5-2 שעות.</li>
	<li>מעבירים את החלבונים מהג'ל לקרום פוליווינילידן דיפלוריד (PVDF) של 45 מיקרומטר במתח של 110 וולט למשך 1-1.5 שעות.</li>
	<li>מעבירים את קרום PVDF למיכל מתאים עם צד החלבון (הצד שפונה לג'ל) למעלה, ושוטף בקצרה את הקרום במים מזוקקים.</li>
	<li>להשליך את המים, להוסיף פתרון פונסאו S, ולשים את הממברנה על פלטפורמת נדנדה במשך 1-2 דקות.</li>
	<li>דה כתם הממברנה עם מים מזוקקים על ידי שטיפה מהירה ולאחר מכן לשטוף אותו במשך 1 דקה.</li>
	<li>לאחר מכן, שים את קרום PVDF על קופסת אור, וצלם תמונה כדי לבדוק אם יש עומסי חלבון שווים.</li>
	<li>לשטוף את הממברנה עם מלוחים טריס-אגירה עם Tween 20 (TBST, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, ו 0.1% Tween 20) עד שאין כתמים גלויים.</li>
	<li>שים את הממברנה בחסימת חיץ (5% חלב רזה בתמיסת TBST) ודגירה אותו במשך שעה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשטוף את הממברנה פעמיים עם TBST.</li>
	<li>דגירה הממברנה עם נוגדנים ראשוניים נגד זרחן-SMAD2 (p-SMAD2; 1:1000, תוצרת בית 34),סה"כ SMAD2/3 1:1000 ו glyceraldehyde 3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH; 1:1000), לילה ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לשטוף את הממברנה פעמיים עם TBST ולהדגיר את הממברנה עם נוגדן משני נגד ארנב או עכבר (1:5000) במשך 2 שעות.</li>
	<li>דגירה קרום PVDF עם מצע ECL המערבי במשך 30 שניות, ולזהות את האות באמצעות מערכת הדמיה.</li>
	<li>חזור על הניסויים לפחות שלוש פעמים כדי להשיג משולשים ביולוגיים.</li>
</ol>2. ניתוח של תגובות תמלול תלויות SMAD3 הנגרמות על ידי TGF-β
<ol><li>בצע את ה-CAGA12תלוי SMAD3/SMAD4 -לוציפראז שעתוק כתב assay.<ol>
<li>תרבות ותאי MCF10A-Ras עם ניסיון כמתואר בשלב 1. תאי זרע לתוך צלחות 24-באר ב 5×104 תאים / באר ולאפשר לתאים לדבוק בן לילה.</li>
		<li>יום לאחר הזריעה, cotransfect התאים בכל באר עם 100 ng של TGF-β / SMAD3-בלתי ניתן להקרבה (CAGA)12 כתב שעתוק לוציפראז לבנות35 ו 80 ng של מבנה ביטוי β-גלקטוזידאז באמצעות פוליאתילנימין (PEI). ההעתקה של β-גלקטוזידאז משמשת לנרמול הבדלים ביעילות התת-הדבקה בין בארות שונות. להקים כל קבוצת ניסוי משולשת.</li>
		<li>לאחר 24 שעות של דגירה, תאים גוועים ברעב עם גלוקוז גבוה DMEM ללא סרום, 6 שעות מאוחר יותר, להוסיף TGF-β (5 ng/mL) או חיץ ליגנד (4 mM HCl, 0.1% BSA) כבקרת רכב לתאים.</li>
		<li>לאחר עוד 24 שעות של דגירה, לשטוף תאים פעמיים עם PBS מראש.</li>
		<li>מוסיפים 120 μL / גם 1× מאגר תמוגה בעדינות לנער את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.</li>
		<li>העבר 30 μL של lysate לכל באר של microplate 96-well לבן assay כדי למדוד פעילות לוציפראז באמצעות לומינומטר.</li>
		<li>העבר 50 μL של lysate לכל באר של צלחת שקופה 96-היטב כדי למדוד פעילות β-גלקטוזידאז.</li>
		<li>לנרמל את פעילות לוציפראז לפעילות β-גלקטוזידאז ולחזור על הניסויים לפחות שלוש פעמים כדי להשיג משולשים ביולוגיים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לנתח את הביטוי של TGF-β גנים היעד באמצעות תגובת שרשרת כמותית בזמן אמת פולימראז (qRT-PCR).<ol>
<li>תרבות ותאי MCF10A-Ras עם ניסיון כמתואר בשלב 1. תאי זרע לתוך צלחות 6-באר ב 5×105 תאים / באר ולאפשר לתאים לדבוק בן לילה.</li>
		<li>לטפל בתאים עם TGF-β (5 ng/mL) או מאגר ליגנד (4 mM HCl, 0.1% BSA) במשך 6 שעות, ולאחר מכן לשטוף את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של PBS.</li>
		<li>לבודד את ה-RNA הכולל באמצעות ערכת בידוד RNA.</li>
		<li>לקבוע את ריכוז RNA עם NanoDrop ולבצע סינתזת cDNA עם 1 מיקרוגרם של RNA באמצעות ערכת סינתזה cDNA גדיל הראשון.</li>
		<li>השתמש במערכת זיהוי PCR בזמן אמת כדי לבצע כמותי בזמן אמת PCR (qRT-PCR) עם cDNA מדולל פי עשרה בתערובת תגובת μL 10 הכוללת פריימרים אנושיים ספציפיים קדימה והפוך עבור GAPDH (לנורמליזציה), SERPINE1 (קידוד חלבון PAI-1, גן יעד TGF-β/SMAD), SMAD7 (גן יעד TGF-β/SMAD) ו- qPCR מאסטר מיקס. להקים כל קבוצת ניסוי משולשת. הערה: רצפי פריימר המשמשים לזיהוי גנים אנושיים ממוקדים ב qRT-PCR מפורטים בטבלה 1.</li>
		<li>השתמש בתנאי התגובה הבאים qPCR: אתחול, 95 °C (69 °F) במשך 3 דקות; דנטורציה, 95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות; חישול, 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות; והרחבה, 80 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות; דנטורציה, חישול והרחבה חוזרים על עצמם 40 פעמים.</li>
		<li>חזור על הניסויים לפחות שלוש פעמים כדי להשיג משולשים ביולוגיים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ניתוח של EMT הנגרמת על ידי TGF-β
<ol><li>לנתח את הביטוי של סמני EMT ברמת החלבון באמצעות סופג מערבי. הערה: הניתוח של EMT הנגרמת על ידי TGF-β מוצג באמצעות תאי אפיתל NMuMG העכבר כדוגמה36,37.<ol>
<li>תרבות NMuMG תאים ב 37 °C (70 °F) במדיום גלוקוז DMEM גבוה בתוספת 10% סרום שור עוברי ו 1:100 עט סטרפטוקוקוס. השתמש בשיטות המתוארות בשלב 1 לבידוד וזיהוי חלבונים. הערה: הנוגדנים הבאים משמשים בניסוי זה: E-cadherin, 1:1000; נ-קדרין, 1:1000; חילזון, 1:1000; שבלול, 1:1000; טובולין, 1:1000(איור 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>נתח את הביטוי של סמני EMT ברמת mRNA באמצעות PCR כמותי בזמן אמת כמתואר בשלב 2.2. הערה: כל פריימרים לעכברים המשמשים עבור qRT-PCR, כולל CDH1 (קידוד חלבון E-cadherin), SNAILו- ZEB2 (איור 3) מפורטים בטבלה 1.</li>
	<li>לנתח את תהליך EMT באמצעות שפעת חיסונית עקיפה וכתם פלואורסצנטי ישיר.<ol>
<li>כתמי כשל חיסוני עקיף של E-cadherin<ol>
<li>מניחים כיסויי זכוכית מרובעים סטריליים בגודל 18 מ"מ בצלחות של 6 בארות (כיסוי אחד לבאר).</li>
			<li>זרע 1×105 תאי NMuMG עם 2 מ"ל של DMEM מלא לכל צלחת 6 באר ולאפשר לתאים לדבוק בן לילה.</li>
			<li>מעבירים בעדינות את הכיסויים עם תאים דבקים לצלחת חדשה של 6 בארות ומוסיפים 2 מ"ל של מדיום תרבות לבארות.</li>
			<li>לטפל בתאים עם TGF-β (5 ng/mL) או מאגר ליגנד (4 mM HCl, 0.1% BSA) במשך 2 ימים.</li>
			<li>הסר את מדיום התרבות בעדינות לשטוף את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של PBS מראש.</li>
			<li>לתקן את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde ודגרת במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף בעדינות את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של PBS.</li>
			<li>לחלחל לתאים הקבועים עם 0.1% טריטון X-100 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולשטוף את התאים פעמיים עם PBS.</li>
			<li>חסום את התאים עם 5% BSA ב PBS במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ולשטוף את התאים פעמיים עם PBS.</li>
			<li>הוסף את הנוגדן העיקרי נגד E-cadherin (מדולל 1:1000 ב PBS) לחלק העליון של כל כריכה דגירה במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.</li>
			<li>הסר את הנוגדן העיקרי ולשטוף את הכיסוי עם PBS שלוש פעמים.</li>
			<li>הוסף את הנוגדן המשני Alexa Fluor 555 (מדולל 1:500 ב- PBS) לחלק העליון של כל כיסוי ודגר במשך שעה בטמפרטורת החדר תוך כיסוי בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור.</li>
			<li>הסר את הנוגדן המשני ולשטוף את הכיסוי עם PBS שלוש פעמים.</li>
			<li>הר את הכיסוי (תאים הפונים כלפי מטה) על שקופיות זכוכית באמצעות מדיום הרכבה עם 4′,6-diamidino-2-פנילינדול (DAPI) ולאחסן את השקופיות רכוב בתיבה ב 4 °C (6 °F), מוגן מפני אור.</li>
			<li>שימו לב לכתמים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית SP8.</li>
		</ol>
</li>
		<li>כתמי פלואורסצנטיות ישירים של סיבים (F)-actin.<ol>
<li>הכן דגימות לפי שלבים 3.3.1.1. ל-3.3.1.9.</li>
			<li>הכתים את התאים על ידי הוספת Alexa Fluor 488 Phalloidin (1:1000) במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בחושך כדי לדמיין אקטין סיבי (F-actin).</li>
			<li>לשטוף תאים שלוש פעמים עם PBS.</li>
			<li>טען את החלקה על שקופיות זכוכית באמצעות מדיום הרכבה עם DAPI וצלם תמונות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית SP8.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

TGF-β/SMAD איתות ממלא תפקיד מרכזי בהתקדמות סרטן השד, כפי שהוא יכול לקדם את פולשניות התא סרטן השד גרורות על ידי גרימת EMT7. כאן, תיארנו זרימת עבודה הגיונית כדי לחקור איתות ביוזמת TGF-β מהפעלת SMAD הנגרמת על ידי קולטן לתגובות שעתוק וביולוגיות בתיווך SMAD. התחלנו בתיאור הניתוח של זרחון SMAD2, המשכנו עם תגובות שעתוק תלויות SMAD3 הנגרמות על ידי TGF β וביטוי סמן EMT הן ברמת הגן והן ברמת החלבון כדי לנתח את תגובת האיתות TGF-β / SMAD, ולבסוף בדקתי את ה- EMT המושרה על ידי TGF-β. השתמשנו כתב שעתוק CAGA12-luciferase המכיל תיבות CAGA נגזר מקדם PAI-1, כדי לפקח על הפעילות של TGF-β / SMAD איתות מסלול35. מבנה כתב זה דורש SMAD3 ו- SMAD4 להפעלה. מחקרים קודמים הראו כי ההפלה של SMAD4 מוחלש TGF-β-induced CAGA12-luciferase פעילות37. בנוסף לבדיקת הכתב, קביעת מצב הזרחן של SMADs אנדוגני, כולל SMAD2 ו SMAD3, היא דרך נוספת לחקור את תגובת איתות TGF-β. ואכן, חברים אחרים במשפחת TGF-β, כגון גורם צמיחה ובידול (GDF)-8/מיוסטטין ו- GDF-9, גם מתמר אותות באמצעות חלבוני SMAD2/3 על ידי עיסוק TβRI42,43,44. בנוסף לכתב CAGA12-luciferase, מספר כתבים דומים שימשו כדי לזהות את ההפעלה של איתות TGF-β. לדוגמה, כתב שעתוק (SBE) 4 -Lux עם רכיביתגובההנגזרים ממקדם JunB יכול להיגרם ביעילות על ידי TGF-β, activins ו BMPs45.
כתמים מערביים ו qPCR שימשו לניתוח TGF-β-induced EMT, שהן שיטות קלאסיות לחקור את הביטוי של סמני אפיתל (כלומר, E-cadherin) וסמנים mesenchymal (כלומר, N-cadherin, חילזון, שבלול ו Zeb2). ביצענו גם כתמי כשל חיסוני עקיף של E-cadherin וכתם פלואורסצנטי ישיר של F-actin. מבחנים אלה עוד יותר אימת את פנוטיפ mesenchymal של תאים לאחר טיפול TGF-β. המגבלה של כתמי כשל חיסוני היא שיש לתקן תאים לפני הדגירה עם נוגדנים והדמיה, וקשה לחקור שינויים בביטוי סמן EMT בתאים חיים. לאחרונה, העיצוב של קווי תא כתב EMT, כגון A549 ריאות אדנוקרצינומה-vimentin-RFP, אפשר לפקח על הטרנספורמציה של תאי אפיתל לתאים mesenchymal בזמן אמת באמצעות הביטוי של חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP)מתויג vimentin. פלטפורמה זו יכולה להיות מנוצלת עבור הקרנת סמים ופיתוח תרופות חדשות46. צבע LifeAct, פפטיד 17-חומצת אמינו, שיכול להכתים מבני F-actin בתאים חיים, הופך לכלי רב ערך כדי לדמיין את ציטוסקלטון actin בזמן אמת מבלי להפריע לתהליכים הסלולר47. במחקר זה, השתמשנו בשני מעכבי מולקולה קטנה, SB431542 ו- GW788388, כדי לאמת את ההשפעה המעכבת שלהם על איתות TGF-β ו- EMT הנגרמת על ידי TGF-β. יש לציין כי GW788388 מעכב בעוצמה את פעילות TβRI ו- TβRII, בעוד של- SB431542 יש השפעה מעכבת רק על TβRI (ו- ALK4 ו- ALK7). מחקרים קודמים גילו כי GW788388 הוא חזק יותר vivo מאשר SB43154240. בנוסף לעיכוב של EMT, GW788388 הפחית את הביטוי של סמני פיברוזיס בכליה, ואת הממשל אוראלי של GW788388 בעכברים סוכרתיים ירד במידה ניכרת גלומרולופתיה25,48.
EMT ממלא תפקיד חיוני בקידום פלסטיות תא סרטן ותוצאות עמידות לתרופות גרורות 49. לכן, מיקוד תאים נגזרי EMT עם תרופות ציטוטוקסיות ספציפיות50 או גרימת חלוקה מחדש באמצעות מעבר mesenchymal-to-אפיתל (MET)51 הוצע כגישה להתגבר על גרורות תאים סרטניים והתנגדות לטיפול. עם זאת, MET תורם לשגשוג של תאים סרטניים מופצים באיברים רחוקים52, אשר עשוי להיות מועיל בעת שימוש בהיפוך הטיפולי של EMT. לאחרונה, מחקר חדש דיווח על גישה טיפולית transdifferentiation על ידי מיקוד ישיר EMT נגזר תאים סרטניים השד עבור בידול לתוך adipocytes30. מחקרו של ישי-רונן ואח' Al.30 השתמשו בתאי סרטן אפיתל מורין Py2T שעברו מעבר לתאים mesenchymal בתגובה לטיפול ארוך טווח עם TGF-β. הם הראו כי rosiglitazone בשילוב עם מעכבי MEK משופרת בידול אפיתל ו adipogenesis. עם זאת, מצאנו כי rosiglitazone לבד היה מספיק כדי לגרום transdifferentiation של תאים מורין Py2T mesenchymal לתוך adipocytes.
לסיכום, השיטות המשמשות במחקר זה סיפקו זרימת עבודה הגיונית כדי לחקור איתות TGF-β ו- EMT הנגרמת על ידי TGF-β. שני המעכבים, SB431542 ו- GW788388, יכולים לחסום תגובות הנגרמות על ידי TGF-β ו- EMT. בנוסף, הדגמנו גם rosiglitazone לבד גורם adipogenesis מסוימים TGF-β-induced תאים סרטן השד mesenchymal. למרות שהשתמשנו רק בכמה קווי תאים סרטניים בשד כדי לחקור תגובות TGF-β, השיטות המתוארות כאן יכול להיות extrapolated לתאים אחרים (סרטן). כאן, השתמשנו בריכוזים שונים של β TGF כדי לגרום לתגובות סלולריות. ברוב סוגי התאים, TGF-β מפעילה את פעילותה הביולוגית בטווח הריכוז של 0.01-10 ng/mL53 וגורם לאיתות בתבנית תגובת מינון. בתאי אנדותל ראשוניים, כולל תאי אנדותל אבי העורקים שור, TGF-β המושרה הביטוי המשמעותי של SMAD2 phosphorylated ב 0.025 ng/mL, הגיע למקסימום ב 0.25 ng/mL, ונשאר ברמה זו בתגובה ריכוזים גבוהים יותר53. במחקר שלנו, השתמשנו בריכוז גבוה של TGF-β (5 ng/mL) בתאי MCF10A-ראס לבדיקת הכתב שעתוק כדי לקבל תגובות חזקות. SMAD2 זרחון וביטוי גנים היעד יכול להיגרם על ידי TGF-β במינון נמוך; לכן, השתמשנו 2.5 ng/mL TGF-β לטיפול בתאים. עם זאת, ריכוז העבודה המתאים ביותר תלוי בסוג התא ובאפקטים המשוערים. כדי לקבוע את הריכוז הטוב ביותר של TGF-β, מומלץ לטפל בתאים במינונים שונים (מנמוך לגבוה).

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61830/studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal">Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>.&#160;NMuMG was mislabeled as&#160;cancer cells.
NMuMG cells are non-transformed epithelial breast cells established from a mouse mammary gland. NMuMG cells are frequently used as a model system to investigate TGF-&#946;-induced epithelial to mesenchymal transition (EMT). EMT is induced by TGF-&#946; in premalignant human MCF 10A-RAS (M2) cells and mouse MMTV-PyMT breast cancer cell line. The article has been updated to reflect this.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61830/studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal">Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>.&#160;NMuMG was mislabeled as&#160;cancer cells.

Erratum: Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

ציטוקינים שינוי פקטורי גדילה-β (TGF-β) הוא אב טיפוס של קבוצה גדולה של פוליפפטידים רגולטוריים הקשורים מבנית ותפקודית כולל TGF-βs (כלומר, TGF-β1, -β2 ו -β3), חלבונים מורפוגניים עצם (BMPs) ו activins1,2. ציטוקינים אלה ממלאים תפקידים חשובים בהתפתחות העוברית ובתחזוקת הומאוסטזיס רקמות ואיברים3. misregulation של TGF-β יכול להוביל למגוון רחב של מחלות, כולל סרטן4,5. TGF-β ממלא תפקיד מורכב, כפול בהתקדמות סרטן: בתאי אפיתל נורמליים טרום מלמיניים, TGF-β מתנהג כמו מדכא גידול על ידי עיכוב התפשטות וגרימת אפופטוזיס6,7; עם זאת, בשלב המאוחר של התקדמות הגידול, כאשר תגובות ציטוסטטיות נחסמות על ידי הפעלה של אונקוגנים או אובדן של גנים מדכאי גידולים, TGF-β פועלת כמשפרת גידולים על ידי קידום מעבר אפיתל-mesenchymal (EMT) בתאי סרטן, ובכך לאפשר פלישת תאים סרטניים גרורות, הפועל על תאים microenvironment הגידול, וגירוי אנגיוגנזה והתחמקות החיסון8,9,10.
TGF-β מופרש כמו מולקולת קודמן לא פעיל המכיל את β TGF-מסוף קרבוקסיה בוגרת ופפטיד הקשורים להשהיה (LAP)11. קומפלקס קטן זה יכול להיות כבול בקובאליות על ידי חלבון סמוי TGF-β מחייב (LTBP)12. שחרורו של בוגר TGF-β יכול להיות מתווך על ידי פעולה של פרוטאזות ספציפיות כי cleave LAP או על ידי משיכה מכנית של LAP בתהליך תלוי integrin13,14. בנוסף ל- LTBP, גליקופרוטאין A חוזר דומיננטי (GARP) מתבטא מאוד על פני השטח של תאי T רגולטוריים (Tregs) וממלא תפקיד דומה לזה של LTBP בוויסות ההפעלה של TGF-β15,16. GARP נקשר ישירות β TGF-β סמויים באמצעות הצמדה דיסולפידית ושיוך לא-קוולנטי. ההפעלה של TGF-β ממתחם GARP / TGF-β דורשת אונטגרינים17. בוגרת TGF-β נקשר TGF-β קולטני סרין / threonine קינאז, כלומר, TGF-β סוג I (TβRI) ו TGF-β סוג II (TβRII) קולטנים18 ליזום איתות. הכריכה של TGF-β ל- TβRII מקדמת את גיוס TβRI והקמת מתחם הטרומרי. לאחר מכן, TβRI הוא phosphorylated על ידי קינאז TβRII על שאריות סרין ותרונין במוטיב קצר גליצין- וסרין עשיר (GS), וכתוצאה מכך הפעלתו19,20. עם ההפעלה, TβRI מופעל מגויסים phosphorylates המצעים שלה: שני SMADs ספציפי לקולטן (R-SMADs) הכוללים SMAD2 ו SMAD3 (איור 1). R-SMADs חולקים מבנה כולל דומה עם שני תחומים שנקראים Mad homology, MH1 ו- MH2, המופרדים באמצעות אזור קישור עשיר בפרולין (איור 2). מוטיב כריכת ה- DNA בתחום MH1 של SMAD3 אינו נשמר בין SMAD2 ל- SMAD3, ו- SMAD2 אינו יכול לאגד ישירות DNA עקב שתי הוספות בתחום MH1 שלו (exon 3 ו- L1). SMAD2 ו-SMAD3 יכולים להיות מופעלים על ידי הזרחון של מוטיב ה-SSXS בטרמיני C שלהם (איור 2). Phosphorylated SMAD2/3 יוצר מתחמים הטרומריים עם מתווך SMAD משותף, SMAD4, אשר טרנסלוקציה לתוך הגרעין כדי לווסת את שעתוק של גנים היעד (איור 1)7,21. מסלול איתות SMAD קנוני זה מוסדר במדויק ומייצר תגובות ספציפיות לתאים ולרקמות כגון ויסות גורל התא וגרורות תאים סרטניים ופלישה22. בנוסף לאיתות TGF-β-SMAD, מסלולי איתות שאינם SMAD יכולים להיות מופעלים ישירות גם על ידי קולטנים כדי לווסת תגובות סלולריות במורד הזרם23.
במהלך התקדמות הגידול, ההפעלה של TGF-β-induced SMAD-induced מסלולים עצמאיים SMAD נדרשים אינדוקציה של EMT. EMT הוא תהליך הפיך שבו תאים סרטניים dedifferentiate מפנוטיפ אפיתל, אשר קשורה לאובדן של מגעים תא-תא וירידה קוטביות אפית-בסיסית, כדי פנוטיפ mesenchymal עם תנועתיות משופרת ויכולת הפלישה24. EMT מאופיין בביטוי מוגבר של חלבוני סמן mesenchymal, כולל N-cadherin, vimentin, Zeb2 ו חילזון1/2, ואת הסרת הפיקוח בו זמנית של סמני אפיתל, כגון E-cadherin ו β-catenin (איור 3)25. עם זאת, המעבר מאפיתל למצב mesenchymal הוא לעתים קרובות לא שלם, ותאים לקבל מאפיינים אפיתל מעורב mesenchymal (E/M). מאמר שפורסם לאחרונה על ידי האגודה הבינלאומית EMT הציע לתאר את התהליך של תאים שעברו מצבי ביניים E / M phenotypic כמו פלסטיות אפיתל-mesenchymal (EMP)26. פלסטיות זו מתייחסת EMT חלקית, מצב E / M היברידית, מצב EMT metastable, רצף EMT ספקטרום EMT26. במהלך EMT, תאים סרטניים להשיג תכונות תא גזע סרטני (CSC) ולהיות עמידים יותר אפופטוזיס הנגרמת על ידי ניתוק27. בעוד EMT אחראי על רכישת פנוטיפ פולשני בתאים סרטניים ראשוניים ומניע התקדמות סרטן, לעומת זאת, מעבר mesenchymal-אפיתל (MET) הוכח לשחק תפקיד חשוב בצמחייה של תאים סרטניים שהופצו באתרים גרורתיים רחוקים28,29. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי תאים סרטניים השד נגזר EMT ניתן transdifferentiated לתוך adipocytes, אשר עשוי להציע הזדמנות לעכב גרורות להתגבר על עמידות לטיפול בתאי הגידול וסרטן התדרדר30. בשל התפקיד החשוב של TGF-β איתות בהפעלה של EMT ב carcinogenesis השד, אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים עבור סופג המערבי, בדיקת שעתוק לוציפראז, תגובת שרשרת כמותית בזמן אמת פולימראז (qRT-PCR), ו immunofluorescence לחקירה של TGF-β איתות, TGF-β-induced EMT, ואת transdifferentiation של תאי גידול אפיתל השד מורין נגזר EMT לתוך אדיפוציטים. טכניקות אלה הן הכלים האנליטיים הנפוצים ביותר בתחום הביולוגיה של התא. qRT-PCR משמש לזיהוי, אפיון וכימות רמות ביטוי mRNA באופן כמותי. בהשוואה ל- PCR כמותי (qPCR), טכניקה חלופית, ניתן להשתמש בתעתיק ההפוך (RT)-PCR כדי לקבוע ביטוי mRNA באופן חצי כמותי31,32. כתמים מערביים משמשים לבחינת רמות חלבון ספציפיות במדגם ליסנט תא נתון עם יתרונות של רגישות וספציפיות, באופן חצי כמותי. לכן, אנו מציגים זרימת עבודה שיטתית כדי לנתח שינויים מביטוי גנים לביטוי חלבון כדי לעזור לחקור איתות TGF-β שניתן להחיל גם על מסלולי איתות אחרים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm-side square glass coverslips</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>631-1331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-E-cadherin antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) antibody</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-N-cadherin antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Slug antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SMAD2/3 antibody</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>610842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Snail antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tubulin antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera enterotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1705060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-high glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-high glucose medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11039047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>01-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S1860-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq qPCR Master Mix</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>A600X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>91077C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA II kit</td>
			<td>BIOKE&#180;</td>
			<td>740955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (Pen-Strep)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K1621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skimmed milk</td>
			<td>Campina: Elk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>17001402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>2030-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying tgf-&#946; signaling and tgf-&#946;-induced epithelial-to-mesenchymal transition in breast cancer and normal cells

שינוי פקטורי גדילה-β (TGF-β) הוא גורם רב תכליתי מופרש הממלא תפקיד מפתח בתקשורת בין-תאית. הפרעות של איתות TGF-β יכול להוביל לסרטן השד. TGF-β מעורר את השפעותיו על התפשטות ובידול באמצעות משטח תא ספציפי TGF-β סוג I קולטנים מסוג II (כלומר, TβRI ו TβRII) המכילים תחום פנימי סרין / threonine קינאז. על היווצרות מורכבת הטרומרית הנגרמת על ידי TGF-β, מופעל TβRI מעורר איתות תאי על ידי phosphorylating SMAD2 ו SMAD3. אלה SMADs מופעל טופס קומפלקסים הטרומריים עם SMAD4 כדי לווסת גנים היעד ספציפי, כולל מעכב הפעלת פלסמינוגן 1 (PAI-1, מקודד על ידי הגן SERPINE1). האינדוקציה של מעבר אפיתל-mesenchymal (EMT) מאפשר תאים סרטניים אפיתל באתר הראשי או במהלך קולוניזציה באתרים מרוחקים כדי להשיג פנוטיפ פולשני ולהניע התקדמות הגידול. TGF-β פועל כגרום חזק של פלישה לסרטן השד על ידי נהיגה EMT. כאן, אנו מתארים שיטות שיטתיות לחקור TGF-β איתות ותגובות EMT באמצעות תאים MCF10A-RAS אנושיים קדם-מיניים (M2) ותאי אפיתל NMuMG העכבר כדוגמאות. אנו מתארים שיטות כדי לקבוע TGF-β-induced SMAD2 זרחון על ידי סופג המערבי, SMAD3 / SMAD4 תלוי פעילות שעתוק באמצעות פעילות כתב לוציפראז ו SERPINE1 ביטוי גנים היעד על ידי תגובת שרשרת כמותית בזמן אמת פולימראז (qRT-PCR). בנוסף, מתוארות שיטות לבחון את ה- EMT הנגרמת על ידי TGF-β על ידי מדידת שינויים במורפולוגיה, ביטוי סמן אפיתל ומזנכימלי, כתמי אקטין סיביים וכתם כשל חיסוני של E-cadherin. שני מעכבי קינאז קולטן TGF-β מולקולה קטנה סלקטיבית, GW788388 ו- SB431542, שימשו לחסימת זרחון SMAD2 המושרה β על ידי TGF, גנים ממוקדים ושינויים בביטוי סמן EMT. יתר על כן, אנו מתארים את ההשתנות של השד mesenchymal Py2T תאי גידול אפיתל מורין לתוך adipocytes. שיטות לבחון TGF-β-induced איתות EMT בסרטן השד עשוי לתרום גישות טיפוליות חדשות לסרטן השד.

ניתוח איתות TGF-β השלב המרכזי באיתות TGF-β הוא הזרחון של שתי שאריות הסרין של מסוף הקרבוקסי ביותר במוטיב SSXS(איור 2)מאת TβRI kinase38,39. כדי לחקור תגובות איתות TGF-β, ביצענו סופג המערבי של SMAD2 זרחן. בתאי ה-MCF10A-Ras של השד האנושי, הזרחן של SMAD2 גדל באופן משמעותי בתגובה לגירוי β TGF במשך שעה, בעוד שהביטוי של SMAD2/3 הכולל לא הושפע מטיפול TGF-β (איור 4A). על ידי שימוש ב-SMAD3/4-induced TGF-β-induced CAGA-luc שעתוק הכתב assay, מצאנו כי TGF-β המושרה במידה ניכרת כתב לוציפראז בקו תאים MCF10A-ראס בהשוואה לתאים שאינם מטופלים (איור 4B). יתר על כן, ראינו כי מטרות גנים שעתוק ישיר מאופיין היטב של TGF-β כולל SMAD7 ו SERPINE1 (קידוד חלבון PAI-1), באו לידי ביטוי מאוד בתאי MCF10A-Ras שטופלו β TGF(איור 4C).
ניתוח של EMT הנגרמת על ידי TGF-β הערכנו את ה- EMT המושרה על ידי TGF-β בשיטות שונות, כגון שינויים מורפולוגיים, ביטוי של סמני EMT ברמות mRNA וחלבון וכתמים אימונופלואורסצנטיים של סמני EMT36. תאי אפיתל NMuMG שטופלו β TGF במשך יום ויומיים השתנו ממורפולוגיה אפיתל קלאסית למורפולוגיה דמוית מסנצ'יאל בצורת ציר, כפי שמוצג על ידי מיקרוסקופיית ניגוד פאזה (איור 5A). בהתאם לשינויים המורפולוגיים, ראינו כי טיפול TGF-β הוביל לעלייה בביטוי החלבון של סמנים mesenchymal, כולל N-cadherin, חילזון, ו שבלול37 (איור 5B). לעומת זאת, E-cadherin, סמן אפיתל, היה downregulated בתאי NMuMG לאחר 2 ימים של טיפול TGF-β (איור 5B). בנוסף, ביצענו תגובת שרשרת כמותית בזמן אמת פולימראז (qRT-PCR) כדי לחקור את ביטוי הגנים של סמני EMT. CDH1 (קידוד חלבון E-cadherin) ירד באופן משמעותי, בעוד סמנים mesenchymal כגון SNAIL ואבץ אצבע E-box מחייב homeobox 2 (ZEB2) גדלו במידה ניכרת לאחר גירוי TGF-β בתאי NMuMG לעומת תאים לא מטופלים(איור 5C). TGF-β-induced EMT בתאי NMuMG אושרה עוד יותר על ידי כתמי כשל חיסוני של E-cadherin. לאחר גירוי TGF-β במשך יומיים, תאי NMuMG הביעו פחות E-cadherin מאשר תאים בקבוצת הביקורת uninduced, כפי שנותח על ידי מיקרוסקופיה confocal (איור 5D). יתר על כן, תאי NMuMG בנוכחות TGF-β יצרו יותר סיבי מתח אקטין, כפי שמוצג על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית (איור 5E).
SB431542 ו- GW788388 מעכבים איתות TGF-β ו- EMT הנגרמת על ידי TGF-β SB431542 הוא מעכב תחרותי ATP של תחום קינאז של TβRI, המכונה גם קולטן activin כמו קינאז 5 (ALK5), בעוד GW788388 מעכב פעילות TβRI ו TβRII קינאז. שני המעכבים יכולים לעכב קולטן TGF-β איתות40. לכן, טיפלנו בתאי NMuMG עם ריכוזים שונים של GW788388 בנוכחות TGF-β במשך שעה אחת. כצפוי, GW788388 עיכב זרחון SMAD2 הנגרמת על ידי TGF-β באופן תלוי מינון (איור 6A). בנוסף, הזרחן בתיווך β TGF של SMAD2 נחסם על ידי טיפול SB431542 (איור 6A). Phosphorylated SMAD2/3 יוצר קומפלקס הטרומרי עם SMAD4 ו translocates לתוך הגרעין כדי לווסת את שעתוק של גנים היעד. לכן, חקרנו את הטרנסלוקציה של SMAD2/3 בתאי NMuMG על ידי כתמי כשל חיסוני של SMAD2/3. הנתונים הראו כי הן SB431542 והן GW788388 עיכבו באופן משמעותי את הטרנסלוקציה הגרעינית הנגרמת על ידי TGF β והצטברות של SMAD2/3 בתאי NMuMG (איור 6B). יתר על כן, ההשפעות המעכבות של SB431542 ו- GW788388 נצפו גם ברמות הביטוי mRNA של גנים חשובים של יעד TGF-β המעורבים ב- EMT, כולל PAI-1, SNAIL, E-cadherin ו- Fibronectin (איור 6C). נתונים אלה הראו כי SB431542 ו- GW788388 חסמו איתות TGF-β ו- EMT הנגרמת על ידי TGF-β.
ניתוח של transdifferentiation של תאים מסרטן השד mesenchymal לתוך adipocytes EMT ממלא תפקיד חיוני בשיפור הפלסטיות התאית בסרטן ותוצאות התפתחות עמידות לטיפול. פלסטיות תא סרטן יכול להיות ממוקד ישירות מעוכב עם גישה טרנס בידול, כגון אדיפוגנזה כפויה30. השתמשנו בתאי סרטן השד Py2T מורין, אשר נגזרו בלוטת החלב של גידול החלב של העכבר וירוס פוליומה התיכון גידול אנטיגן (MMTV-PyMT) עכבר מהונדס, כמודל הסלולר של פלסטיות תאים סרטניים הנגרמת על ידי EMT. בהתבסס על פרוטוקול הוקמה41, טיפלנו EMT נגזר Py2T מורין סרטן השד תאים עם התרופה נגד סוכרת rosiglitazone במשך 10 ימים כדי לגרום אדיפוגנזה. Adipogenesis הוערך על ידי הדמיה טיפות השומנים באמצעות שמן אדום O כתמים. תאי שומן זוהו בקלות בתאי סרטן השד Py2T מורין שטופלו ברוזיגליטזון (איור 7), אשר הראו כי טיפול עם rosiglitazone לבד מספיק כדי לקדם את התעתיק של תאים סרטניים בשד נגזר EMT לתוך אדיפוציטים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig01.jpg"> איור 1: איתות TGF-β/SMAD. איתות TGF-β יוזם עם מחייב של TGF-β לקולטן מסוג TGF-β II (TβRII), קינאז פעיל מכונן, כי phosphorylates TGF-β סוג אני קולטן (TβRI). לאחר מכן, מופעל TβRI קינאז זרחן SMAD2/3. פפטיד המכיל את מוטיב SSXS של SMAD2 עם שתי שאריות סרין מסוף קרבוקסיה שימש להשגת אנטיסרה פוליקלוני זיהוי זרחן-SMAD2 (p-SMAD2). לכן, ניתוח של ביטוי p-SMAD2 על ידי סופג מערבי יכול לשמש כדי לקבוע את ההפעלה של מסלול איתות TGF-β. Phosphorylated SMAD2/3 יכול ליצור קומפלקסים הטרומריים עם SMAD4, אשר לאחר מכן טרנסלוקציה לתוך הגרעין כדי לווסת תגובות שעתוק. CAGA12-luciferase כתב assay ו PCR בזמן אמת כמותי (qRT-PCR) עבור ביטוי mRNA של TGF-β גנים היעד כגון SMAD7 ו SERPINE1 (קידוד חלבון PAI-1), ניתן להשתמש כדי לנתח TGF-β-induced SMAD3-induced תגובות שעתוק תלויות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig02.jpg"> איור 2: מבנה סכמטי של מזהי R-SMAD (SMAD2 ו-SMAD3). התחומים MH1 (כחול) ו- MH2 (צהוב) נשמרים בין מזהי R-SMAD, אך אזור המקשר (אפור) אינו נשמר. תחום MH1 של SMAD3 מכיל מוטיב מחייב DNA, בעוד ש- SMAD2 אינו יכול לאגד דנ"א ישירות, עקב הכנסה (exon 3) בתחום MH1 שלו. תחום MH2 מתווך אוליגומריזציה SMAD, אינטראקציה עם קולטני TGF-β, מחייב חלבון והוא מעורב ברגולציה שעתוק. SMAD2 ו SMAD3 יכול להיות מופעל על ידי זרחון של מוטיב SSXS (באדום) בטרמיני C שלהם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig03.jpg"> איור 3: EMT הנגרמת על-ידי β TGF. במהלך מעבר אפיתל-mesenchymal הנגרמת על ידי TGF-β (EMT), התאים עוברים אובדן אפיתל ורכישת מאפיינים mesenchymal עם תנועתיות תאים משופרת ויכולת פלישה. האינדוקציה של EMT מובילה לביטוי של סמנים mesenchymal כגון N-cadherin, Zeb2, ו חילזון1/2, כמו גם downregulation של סמני אפיתל כולל E-cadherin, β קטנין, קלודין-1. ההפסד המצטבר או הרווח של מאפייני אפיתל/mesenchymal (E/M) גורם לתא להיכנס למצבי ביניים באופן הפיך. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig04.jpg"> איור 4: תגובות איתות β TGF בתאי MCF10A-Ras. (A)תאי MCF10A-Ras טופלו עם או בלי TGF-β (2.5 ng/mL) במשך שעה אחת, ו lysates התא היו immunoblotted עבור SMAD2 זרחן (p-SMAD2), סה"כ SMAD2/3 ו GAPDH (כבקרת טעינה). סמן הגודל מוצג מימין. קון: קבוצת בקרה ללא טיפול TGF-β. (ב)ניתוח של פעילות TGF-β (5 ng/mL) באמצעות פעילות CAGA12-luciferase (LUC) התלויה ב- SMAD3-SMAD4 בתאי MCF10A-Ras. הערכים מנורמלים לפעילות β-גלקטוזידאז (βGal). הנתונים מבוטאים כ ממוצע ± s.d, n = 3. מבחן t של התלמיד, ***P ≤ 0.001 (C) qRT-PCR ניתוח של TGF-β גנים היעד SMAD7 ו SERPINE1 (קידוד חלבון PAI-1) בתאי MCF10A-ראס שטופלו TGF-β (2.5 ng/mL) במשך 6 שעות. GAPDH שימש כפקד פנימי. הנתונים מבוטאים כ ממוצע ± s.d, n = 3. מבחן התלמידים, ***P ≤ 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig05.jpg"> איור 5: EMT הנגרמת על-ידי β TGF בתאי NMuMG. (A) מורפולוגיה של תאי NMuMG שטופלו β TGF (2.5 ng/mL) במשך יום או יומיים. בנוכחות TGF-β, תאי NMuMG transdifferentiated לתוך פנוטיפ mesenchymal. סרגל קנה מידה = 150 מיקרומטר (B) תאי NMuMG טופלו עם או בלי TGF-β (5 ng/ mL) במשך 2 ימים, וסמני EMT נותחו על ידי סופג מערבי. סמן הגודל הוא כפי שצוין מימין. קון: קבוצת בקרה ללא טיפול TGF-β. (C) ניתוח ביטוי גנים של סמני EMT (CDH1 (קידוד חלבון E-cadherin), חילזון ו ZEB2) בתאי NMuMG שטופלו במשך יומיים עם TGF-β (5 ng/mL). GAPDH שימש כפקד פנימי. התוצאות מבוטאות כ ממוצע ± s.d., n = 3. *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001. (D)תאי NMuMG הוכתמו על ידי אימונופלואורסצנטיות כדי לזהות את הביטוי של סמן אפיתל E-cadherin (אדום) לאחר טיפול TGF-β (2.5 ng/mL) במשך 2 ימים. גרעינים היו מוכתמים ב- DAPI (כחול). תמונות נלכדו במיקרוסקופיה קונפוקלית. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר (E) תאי NMuMG היו מוכתמים בפלואורסצנטין-פאלודין (ירוק) כדי לדמיין F-actin. גרעינים היו מוכתמים ב- DAPI (כחול). סרגל קנה מידה = 50 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig05large.jpg" target="_blank">מיקרומטר.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig06.jpg"> איור 6: TGF-βsignaling ו- EMT הנגרמת על ידי TGF-β עכבות על ידי SB431542 ו- GW788388. (A)תאי NMuMG טופלו עם 10 מיקרומטר של SB431542 (SB) או הריכוזים המצוינים של GW788388 (GW) בנוכחות או היעדר TGF-β (5 ng/mL) במשך שעה אחת. lysates התא היו immunoblotted עבור p-SMAD2, SMAD2/3 ו GAPDH. (B)תאי NMuMG טופלו עם 5 מיקרומטר של SB431542 (SB) או 10 מיקרומטר של GW788388 (GW) בנוכחות או היעדר 5 ng/mL של TGF-β במשך שעה אחת מוכתם על ידי immunofluorescence כדי לזהות את ההעתקה הגרעינית של SMAD2/3 (ירוק). תמונות נלכדו במיקרוסקופיה קונפוקלית. (C) ביטוי של גנים היעד TGF-β, כולל PAI-1 וגנים קידוד סמני EMT, כולל SNAIL, E-Cadherin ו Fibronectin, נותחו על ידי תגובת שרשרת פולימראז תעתיק הפוך (RT-PCR) בתאי NMuMG לאחר טיפול SB או GW וגירוי TGF-β במשך 48 שעות. GAPDH שימש כבקרת טעינה. הפקד מציין תאים שאינם מטופלים. נתון זה שונה מ פיטרסן M. ואח' . 34 באישור המפרסם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig06large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig07.jpg"> איור 7: ניתן לגרום לתאי סרטן השד מורין Py2T שמקורם ב-EMT להבדיל ביניהם לאדיפוציטים. Py2T מורין סרטן השד תאים היו מגורה עם 2 ng/mL TGF-β במשך 20 ימים כדי לגרום EMT להשלים. לאחר מכן, התאים טופלו גם עם DMSO כבקרת רכב או rosiglitazone (2 מיקרומטר) במשך 10 ימים כדי לאפשר את הבידול של תאים סרטניים mesenchymal ולעורר אדיפוגנזה. המדיום הוחלף כל יומיים. לאחר 10 ימים של טיפול, התאים היו מוכתמים בשמן אדום O. Scale bar = 50 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig07large.jpg" target="_blank">מיקרומטר.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>מינים</td>
			<td>שם גנים</td>
			<td colspan="2">קדימה (5' עד 3')</td>
			<td colspan="2">הפוך (5' עד 3')</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">אנושי</td>
			<td>גאפ-די</td>
			<td colspan="2">TGCACCACCAקטגקטגC</td>
			<td colspan="2">GGקטגקטגקטגאג</td>
		</tr>
<tr>
<td>SMAD7</td>
			<td colspan="2">TCCAגאטגTCC</td>
			<td colspan="2">GTCCגאטגקטג'קג'יק</td>
		</tr>
<tr>
<td>סרפין1</td>
			<td colspan="2">קקאוטגאגג'קקט</td>
			<td colspan="2">קטרג'יג'גטגטגאקאק</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">העכבר</td>
			<td>גאפ-די</td>
			<td colspan="2">TGGקאגטגאטגאטגג'ק</td>
			<td colspan="2">אאגאטגטגאטגגקטקטקג'ג</td>
		</tr>
<tr>
<td>CDH1</td>
			<td colspan="2">ACCAAAGTCGCTGAAGTC</td>
			<td colspan="2">גאגאטגטקאטגאטג</td>
		</tr>
<tr>
<td>חילזון</td>
			<td colspan="2">קגקטגקאקטגט</td>
			<td colspan="2">GCGAGGGCCCCGGAGCA</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZEB2</td>
			<td colspan="2">TTCTGCAAGCTCTGTAGCC</td>
			<td colspan="2">TTCTGGCCCCTGCAT</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: פריימרים המשמשים עבור qRT-PCR.

Watch this Scientific Journal Video about Studying TGF-ÃŽÂ² Signaling and TGF-ÃŽÂ²-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells at JoVE.com

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

אנו מתארים זרימת עבודה שיטתית כדי לחקור איתות TGF-β ו- EMT הנגרמת על ידי β TGF על ידי לימוד ביטוי החלבון והגנים המעורבים במסלול איתות זה. השיטות כוללות סופג מערבי, בדיקת כתב לוציפראז, qPCR, וכתמי כשל חיסוני.

לימוד TGF-β איתות ו TGF-β-induced אפיתל-ל-mesenchymal מעבר בסרטן השד ותאים נורמליים

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...

studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal

Research

JoVE Journal

Cancer Research

12.5K Views.  Leiden University Medical Center. אנו מתארים זרימת עבודה שיטתית כדי לחקור איתות TGF-β ו- EMT הנגרמת על ידי β TGF על ידי לימוד ביטוי החלבון והגנים המעורבים במסלול איתות זה. השיטות כוללות סופג מערבי, בדיקת כתב לוציפראז, qPCR, וכתמי כשל חיסוני.

Video: Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery of the next generation of novel drug targets. It is becoming apparent that more complex models of cancer are required to fully appreciate the contributing factors that drive tumorigenesis in vivo and increase the efficacy of novel therapies that make the transition from pre-clinical models to clinical trials.
Here we present a methodology for generating uniform and reproducible tumor spheroids that can be subjected to siRNA functional screening. These spheroids display many characteristics that are found in solid tumors that are not present in traditional two-dimension culture. We show that several commonly used breast cancer cell lines are amenable to this protocol. Furthermore, we provide proof-of-principle data utilizing the breast cancer cell line BT474, confirming their dependency on amplification of the epidermal growth factor receptor HER2 and mutation of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) when grown as tumor spheroids. Finally, we are able to further investigate and confirm the spatial impact of these dependencies using immunohistochemistry.

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

ניצול הקרנת Genomics פונקציונלית כדי לזהות מטרות תרופה חדשנית פוטנציאלי תרבויות אליפטית תא סרטני

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Synthesis and Characterization of an Aspirin-fumarate Prodrug that Inhibits NF&#954;B Activity and Breast Cancer Stem Cells

Inflammation is a cancer hallmark that underlies cancer incidence and promotion, and eventually progression to metastasis. Therefore, adding an anti-inflammatory drug to standard cancer regiments may improve patient outcome. One such drug, aspirin (acetylsalicylic acid, ASA), has been explored for cancer chemoprevention and anti-tumor activity. Besides inhibiting the cyclooxygenase 2-prostaglandin axis, ASA&#39;s anti-cancer activities have also been attributed to nuclear factor &#312;B (NF&#312;B) inhibition. Because prolonged ASA use may cause gastrointestinal toxicity, a prodrug strategy has been implemented successfully. In this prodrug design the carboxylic acid of ASA is masked and additional pharmacophores are incorporated.
This protocol describes how we synthesized an aspirin-fumarate prodrug, GTCpFE, and characterized its inhibition of the NF&#312;B pathway in breast cancer cells and attenuation of the cancer stem-like properties, an important NF&#312;B-dependent phenotype. GTCpFE effectively inhibits the NF&#312;B pathway in breast cancer cell lines whereas ASA lacks any inhibitory activity, indicating that adding fumarate to ASA structure significantly contributes to its activity. In addition, GTCpFE shows significant anti-cancer stem cell activity by blocking mammosphere formation and attenuating the cancer stem cell associated CD44+CD24- immunophenotype. These results establish a viable strategy to develop improved anti-inflammatory drugs for chemoprevention and cancer therapy.

Synthesis and Characterization of an Aspirin-fumarate Prodrug that Inhibits NF&amp;#954;B Activity and Breast Cancer Stem Cells

This procedure will demonstrate how we synthesized and characterized the anti-NF&#954;B and anti-cancer stem cell activity of an aspirin-fumarate prodrug.

סינתזה ואפיון של prodrug אספירין-fumarate המעכבת תאי גזע סרטניים פעילות השד NFκB

Inflammation is a cancer hallmark that underlies cancer incidence and promotion, and eventually progression to metastasis. Therefore, adding an ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying cancer metastasis in vivo, other efficient, reliable, low-cost models are needed to quickly access the potential effects of (epi)genetic changes or pharmacological compounds. As such, we illustrate and explain the feasibility of xenograft models using human breast cancer cells injected into zebrafish embryos to support this goal. Under the microscope, fluorescent proteins or chemically labeled human breast cancer cells are transplanted into transgenic zebrafish embryos, Tg (fli:EGFP), at the perivitelline space or duct of Cuvier (Doc) 48 h after fertilization. Shortly afterwards, the temporal-spatial process of cancer cell invasion, dissemination, and metastasis in the living fish body is visualized under a fluorescent microscope. The models using different injection sites, i.e., perivitelline space or Doc are complementary to one another, reflecting the early stage (intravasation step) and late stage (extravasation step) of the multistep metastatic cascade of events. Moreover, peritumoral and intratumoral angiogenesis can be observed with the injection into the perivitelline space. The entire experimental period is no more than 8 days. These two models combine cell labeling, micro-transplantation, and fluorescence imaging techniques, enabling the rapid evaluation of cancer metastasis in response to genetic and pharmacological manipulations.

Here, we describe xenograft zebrafish models using two different injection sites, i.e., perivitelline space and duct of Cuvier, to investigate the invasive behavior and to assess the intravasation and extravasation potential of human breast cancer cells, respectively.

התנהגות פולשנית של תאים סרטניים בשד אדם עוברי הזברה

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In particular, endothelial cells (EC) constituting the inner surface of vessels, directly participate in oxygen delivery, nutrient supply, and removal of waste products to and from tumors, and are thereby prominently involved in the constitution of the tumor microenvironment (TME). Tumor endothelial cells (TECs) can be used as cellular biosensors of the intratumoral microenvironment established by communication between tumor and stromal cells. TECs also serve as targets of therapy. Accordingly, in culture these cells allow studies on mechanisms of response or resistance to anti-angiogenic treatment. Recently, it was found that TECs isolated from human colorectal carcinoma (CRC) exhibit memory-like effects based on the specific TME they were derived from. Moreover, these TECs actively contribute to the establishment of a specific TME by the secretion of different factors. For example, TECs in a prognostically favorable Th1-TME secrete the anti-angiogenic tumor-suppressive factor secreted protein, acidic and rich in cysteine-like 1 (SPARCL1). SPARCL1 regulates vessel homeostasis and inhibits tumor cell proliferation and migration. Hence, cultures of pure, viable TECs isolated from human solid tumors are a valuable tool for functional studies on the role of the vascular system in tumorigenesis. Here, a new up-to-date protocol for the isolation of primary EC from the normal colon as well as CRC is described. The technique is based on mechanical and enzymatic tissue digestion, immunolabeling, and fluorescence activated cell sorting (FACS)-sorting of triple-positive cells (CD31, VE-cadherin, CD105). With this protocol, viable TEC or normal endothelial cell (NEC) cultures could be isolated from colon tissues with a success rate of 62.12% when subjected to FACS-sorting (41 pure EC cultures from 66 tissue samples). Accordingly, this protocol provides a robust approach to isolate human EC cultures from normal colon and CRC.

Tumor endothelial cells are important determinants of the tumor microenvironment and the course of the disease. Here, a protocol for the isolation of pure and viable endothelial cells from human colorectal carcinoma and normal colon to be used in drug testing and pathogenesis research is described.

בידוד של תאי אנדותל אדם נורמלי המעי הגס, סרטן המעי הגס - פרוטוקול משופר

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue and its role in local recurrence at the primary tumor site are unknown. Here we present a method for the decellularization, lyophilization, and fabrication of ECM hydrogels derived from murine mammary fat pads. Results are presented on the effectiveness of the decellularization process, and rheological parameters were assessed. GFP- and luciferase-labeled breast cancer cells encapsulated in the hydrogels demonstrated an increase in proliferation in irradiated hydrogels. Finally, phalloidin conjugate staining was employed to visualize cytoskeleton organization of encapsulated tumor cells. Our goal is to present a method for fabricating hydrogels for in vitro study that mimic the in vivo breast tissue environment and its response to radiation in order to study tumor cell behavior.

This protocol presents a method for decellularization and subsequent hydrogel formation of murine mammary fat pads following ex vivo irradiation.

לימוד השפעות קרינת העור נורמלי באמצעות מטריקס הידרותאי הידרו

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and recurrent disease. This population can be identified by surface markers, enzymatic activity and a functional profile. These approaches per se are limited, due to phenotypic heterogeneity and CSC plasticity. Here, we update the sphere-forming protocol to obtain CSC spheres from breast and gynecological cancers, assessing functional properties, CSC markers and protein expression. The spheres are obtained with single-cell seeding at low density in suspension culture, using a semi-solid methylcellulose medium to avoid migration and aggregates. This profitable protocol can be used in cancer cell lines but also in primary tumors. The tridimensional non-adherent suspension culture thought to mimic the tumor microenvironment, particularly the CSC-niche, is supplemented with epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor to ensure CSC signaling. Aiming for robust identification of CSC, we propose a complementary approach, combining functional and phenotypic evaluation. Sphere-forming capacity, self-renewal and sphere projection area establish CSC functional properties. Additionally, characterization comprises flow cytometry evaluation of the markers, represented by CD44+/CD24- and CD133, and Western blot, considering ALDH. The presented protocol was also optimized for primary tumor samples, following a sample digestion procedure, useful for translational research.

The aim of this methodology is to identify cancer stem cells (CSC) in cancer cell lines and primary human tumor samples with the sphere-forming protocol, in a robust manner, using functional assays and phenotypic characterization with flow cytometry and Western blot.

קבלת סרטן גזע כדורים מגינקולוגית סרטן השד גידולים

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction of differentiation of two mouse breast epithelial cell lines, HC11 and EpH4, and their use to study complementary stages of mammary gland development and neoplastic transformation.
The HC11 mouse breast epithelial cell line originated from the mammary gland of a pregnant Balb/c mouse. It differentiates when grown to confluence attached to a plastic Petri dish surface in medium containing fetal calf serum and Hydrocortisone, Insulin and Prolactin (HIP medium). Under these conditions, HC11 cells produce the milk proteins &#946;-casein and whey acidic protein (WAP), similar to lactating mammary epithelial cells, and form rudimentary mammary gland-like structures termed &#34;domes&#34;.
The EpH4 cell line was derived from spontaneously immortalized mouse mammary gland epithelial cells isolated from a pregnant Balb/c mouse. Unlike HC11, EpH4 cells can fully differentiate into spheroids (also called mammospheres) when cultured under three-dimensional (3D) growth conditions in HIP medium. Cells are trypsinized, suspended in a 20% matrix consisting of a mixture of extracellular matrix proteins produced by Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma cells, plated on top of a layer of concentrated matrix coating a plastic Petri dish or multiwell plate, and covered with a layer of 10% matrix-containing HIP medium. Under these conditions, EpH4 cells form hollow spheroids that exhibit apical-basal polarity, a hollow lumen, and produce &#946;-casein and WAP.
Using these techniques, our results demonstrated that the intensity of the cadherin/Rac signal is critical for the differentiation of HC11 cells. While Rac1 is necessary for differentiation and low levels of activated RacV12 increase differentiation, high RacV12 levels block differentiation while inducing neoplasia. In contrast, EpH4 cells represent an earlier stage in mammary epithelial differentiation, which is inhibited by even low levels of RacV12.

We describe techniques for differentiation induction of two breast epithelial lines, HC11 and EpH4. While both require fetal calf serum, insulin, and prolactin to produce milk proteins, EpH4 cells can fully differentiate into mammospheres in three-dimensional culture. These complementary models are useful for signal transduction studies of differentiation and neoplasia.

הבידול של השד העכבר האפיתל HC11 ו EpH4 תאים

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less aggressive breast tumors, the 5-year survival rate of TNBC patients is 77% due to their characteristic drug-resistant phenotype and metastatic burden. Toward this end, murine models have been established aimed at identifying novel therapeutic strategies limiting TNBC tumor growth and metastatic spread. This work describes a practical guide for the TNBC orthotopic model where MDA-MB-231 breast cancer cells suspended in a basement membrane matrix are implanted in the fourth mammary fat pad, which closely mimics the cancer cell behavior in humans. Measurement of tumors by caliper, lung metastasis assessment via in vivo and ex vivo imaging, and molecular detection are discussed. This model provides an excellent platform to study therapeutic efficacy and is especially suitable for the study of the interaction between the primary tumor and distal metastatic sites.

This work presets an advanced protocol to accurately assess tumor loading by detection of green fluorescent protein and bioluminescence signals as well as the integration of quantitative molecular detection technique.

לומדת משולשת סרטן השד שלילי באמצעות אורתובנושא שד סרטן השד מודל

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. Immortalized cell lines are easy to grow and genetically modify to study molecular mechanisms, yet the selective pressure from cell culture often leads to genetic and epigenetic alterations over time. Patient-derived xenograft (PDX) models faithfully recapitulate the heterogeneity and drug response of human breast tumors. PDX models exhibit a relatively short latency after orthotopic transplantation that facilitates the investigation of breast tumor biology and drug response. The transplantable genetically engineered mouse models allow the study of breast tumor immunity. The current protocol describes the method to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad followed by drug treatments. These preclinical models provide valuable approaches to investigate breast tumor biology, drug response, biomarker discovery and mechanisms of drug resistance.

Patient-derived xenograft (PDX) models and transplantable genetically engineered mouse models faithfully recapitulate human disease and are preferred models for basic and translational breast cancer research. Here, a method is described to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad to study tumor biology and evaluate drug response.

השתלה אורתוטופית של גידולי שד כמודלים פרה-אקליניים לסרטן השד

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

בידוד והערכה תפקודית של תאי גזע מסרטן השד האנושי מדגימות תאים ורקמות

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...