La microscopia electrónica serial de la exploración de la bloque-cara proporciona una visión sin precedentes de las estructuras ultra tridimensionales del tejido, y puede contestar a un anfitrión de preguntas previamente imposibles o excesivamente difíciles de perseguir. Esta técnica permite la producción rápida y reproducible de conjuntos de datos tridimensionales con una carga y artefactos de tejido mínimos. Y lo que es más importante, permite la captura automatizada de miles de imágenes diariamente.
La microscopia electrónica de transmisión estándar proporciona una excelente ultraestructura celular. Sin embargo, estas imágenes carecen de contexto tridimensional y pueden ser difíciles de interpretar. La microscopía electrónica de barrido de cara de bloque en serie proporciona ese contexto tridimensional, lo que permite la interpretación de procesos complejos.
Si bien este protocolo es confiable y reproducible, ciertos pasos requieren precisión y son de importancia crítica para el éxito de esta metodología. Este vídeo mostrará estos pasos críticos en detalle. Después de fijar las muestras en tampón de cacodilato de sodio molar, que contiene 2,5% de glutaraldehído, y dos cloruros de calcio milimolares, las muestras deben cortarse en bloques no mayores de dos milímetros en cubos y lavarse con un tampón de cacodilato de sodio molar que contenga dos cloruros de calcio milimolares.
El tejido se tiñe secuencialmente con ferrocianuro de osmio, tiocarbohidrazida y tetróxido de osmio. Después de la incubación del tetróxido de osmio, trate el tejido con acetato de uranilo acuoso al 1% a cuatro grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, disuelva 0.066 gramos de nitrato de plomo en 10 mililitros de solución de ácido aspártico molar, y use un hidróxido de potasio normal para ajustar el pH de la solución de aspartato de plomo de Walton a 5.5.
Después de calentar la solución en el horno, lave el tejido cinco veces durante tres minutos por lavado a temperatura ambiente, agua doble destilada, antes de transferir el tejido a una solución de aspartato de plomo de Walton calentada a 60 grados Celsius durante 30 minutos a 60 grados Celsius. Al final de la incubación, lave el tejido y deshidrate en una serie ascendente de acetona helada, seguida de una incubación de 10 minutos en acetona a temperatura ambiente. Luego coloque el tejido en una proporción de 1:3 de resina mezclada duramente en acetona durante cuatro horas de infiltración en una plataforma giratoria, seguida de una infiltración de ocho horas o durante la noche en una proporción de 1:1 de resina a solución de acetona en una plataforma giratoria, luego, una infiltración nocturna en una proporción de 3:1 de resina a acetona en la plataforma giratoria.
A la mañana siguiente, infiltre el tejido en resina fresca al 100% durante una infiltración de cuatro a ocho horas, una durante la noche y una de cuatro horas a temperatura ambiente en una plataforma giratoria. A la mañana siguiente, use un palo de madera para mezclar una pequeña cantidad de resina con polvo negro de carbono hasta que la resina esté saturada con el polvo, pero todavía es fluida y no se vuelve granulada. La residencia debe parecerse a la tinta gruesa, y ser capaz de gotear lentamente sin grupos visibles Coloque la muestra de tejido en un molde de caucho de silicona, y capturar una imagen para referencia posterior de la orientación de la muestra dentro del bloque de resina.
Cuando la muestra esté en su lugar, cubra el tejido en la resina saturada de negro de carbón en la punta del molde de silicona, con la etiqueta que indica los detalles experimentales y de tejido en el molde en el extremo opuesto de la resina. Luego, coloque el molde en un horno de 65 grados Celsius en una pendiente durante aproximadamente una hora. Cuando la resina infundida de negro de carbón se haya curado lo suficiente, retire el molde del horno, y comenzando con un pozo vacío, llene el resto del molde con resina transparente, teniendo cuidado de que la etiqueta permanezca visible.
Cuando la muestra se haya cubierto con resina transparente, coloque el molde de silicona de nuevo en el horno de 65 grados Celsius, no en una pendiente, durante 48 horas, luego retire el molde. Para preparar el bloque para la toma de imágenes, coloque la muestra incrustada en resina en un mandril de microtoma con el extremo cónico pegando aproximadamente de cinco a seis milímetros fuera del mandril. Bloquee la muestra en su lugar con el tornillo de ajuste y colóque la muestra debajo de una lámpara de calor.
Después de varios minutos, coloque el mandril en un soporte de microscopio estéreo y use una nueva cuchilla de afeitar de doble filo para hacer secciones delgadas paralelas a la cara del bloque hasta que el tejido sea visible, lo que será menos reflectante y granular en comparación con las porciones de la resina que están desprovistas de tejido. Asegure un pasador de espécimen de aluminio en el soporte del pasador de recorte y haga varios arañazos profundos y entrecruzados en la cara del pasador para proporcionar una mayor superficie para el pegamento utilizado para mantener la muestra en su lugar. Coloque la muestra debajo de una lámpara de calor y empuje la maquinilla de afeitar de uno a dos milímetros directamente hacia abajo en el bloque de resina antes de hacer un segundo corte perpendicular de igual profundidad en el bloque, para recortar el exceso de resina de la muestra de tejido para que el bloque sea de aproximadamente tres milímetros de diámetro por dos a tres milímetros de altura.
Después de este recorte inicial, caliente el bloque debajo de la lámpara de calor de nuevo y use una nueva cuchilla de afeitar de doble filo para cortar la parte superior del bloque de resina aproximadamente un milímetro por debajo de la porción recortada en un solo corte suave. Coloque el soporte del pasador de recorte, que contiene el pasador de aluminio cortado, en el receptáculo del estereomicroscopio, y aplique una capa delgada de pegamento de cianocrilato a la cara del pasador de modo que cubra completamente el pasador sin formar un menisco visible. Use fórceps para presionar la pieza recortada de bloque de tejido en el centro de la cara del pasador de la muestra durante varios segundos y permita que el pegamento se ajuste durante varios minutos.
Cuando el pegamento se haya secado a fondo, localice el tejido en la porción elevada del bloque de resina y use una maquinilla de afeitar de doble filo para recortar la porción elevada de la resina que contiene la muestra de tejido a un área no mayor de un milímetro cuadrado. Lenta y cuidadosamente, retire la mayor cantidad posible de exceso de resina, dejando el bloque un poco más largo en una dimensión, y use un archivo de metal final para inclinar el exceso de resina en el área fuera de la porción elevada que contiene la muestra de tejido hacia abajo hacia el borde del pasador. Retire las partículas de resina y el polvo de la muestra preparada antes de aplicar una capa delgada de pintura de plata y pulverización de oro a toda la superficie del bloque de muestra.
Después del recubrimiento, recorte cualquier exceso de pintura plateada de las superficies de la cara del bloque y coloque el bloque montado y recortado en el extremo bulboso de un tubo de pipeta de transferencia hecho a medida con la etiqueta apropiada adjunta. Usando proyección de imagen de SBF-SEM, una red de paquetes elastino-libres de la microfibrrilla se ha identificado dentro de la córnea adulta del ratón. Esta red se organiza en capas distintas, con las fibras estrechamente asociadas con los queratocitos, incluso dentro de invaginaciones poco profundas en la superficie del queratocitos.
El uso de este protocolo ha llevado al descubrimiento de una población previamente desconocida de los nervios córneos centrales que se fundan con las células epiteliales básicas en la frontera stromal-epitelial. La proyección de imagen de SBF-SEM de la córnea central revela la presencia de vasculatura limbal, de paquetes del nervio, y de células asociadas que se puedan segmentar manualmente para la reconstrucción 3D. Algunas trampas de este procedimiento de imágenes incluyen el uso de un tiempo de permanencia de píxeles demasiado largo, que puede causar que las imágenes posteriores sean onduladas y distorsionadas, pequeñas descargas de electrones de la cara del bloque, lo que lleva a cambios rápidos en el contraste en las líneas, arañazos de cuchillo en la cara del bloque debido a un cuchillo dañado o acumulación de escombros en el borde del cuchillo , artefactos de un haz de electrones extendido se centran en la cara del bloque mientras la muestra todavía está en la cámara de imágenes, fijación inadecuada del tejido, lo que lleva a la separación de las estructuras celulares y el tejido conectivo, y la pérdida de imagen como resultado de una gran cantidad de carga dentro del bloque de tejido o resina.
Al cortar el bloque de tejido, es importante tener una buena comprensión de dónde se encuentra el tejido dentro del bloque, Con el fin de no recortar accidentalmente las regiones importantes de la muestra. Si se desean imágenes de mayor resolución de estructuras o interacciones celulares específicas, se puede detener la obtención de imágenes, eliminar el bloqueo del microscopio y cortar secciones en un ultramicrotome donde se pueden ver en un microscopio electrónico de transmisión La microscopía electrónica de barrido de cara de bloque en serie permite una vista totalmente única de los tejidos biológicos. Usando este protocolo, hemos podido adquirir rápidamente conjuntos de datos de calidad y ampliar la gama de tejidos que podemos explorar.
