직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사는 3차원 조직 울트라 구조의 전례없는 보기를 제공하고, 이전에 불가능하거나 추구하기가 매우 어려운 질문의 호스트에 응답 할 수 있습니다. 이 기술을 통해 최소한의 조직 충전 및 아티팩트를 사용하여 3차원 데이터 집합을 빠르고 재현가능한 생산할 수 있습니다. 그리고 중요한 것은 매일 수천 개의 이미지를 자동으로 캡처 할 수 있습니다.
표준 전송 전자 현미경 검사법은 우수한 세포 울트라 구조를 제공합니다. 그러나 이러한 이미지는 3차원 컨텍스트가 부족하며 해석하기가 어려울 수 있습니다. 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사는 복잡한 프로세스의 해석을 허용하는 3차원 컨텍스트를 제공합니다.
이 프로토콜은 신뢰할 수 있고 재현 가능하지만 특정 단계는 정밀도가 필요하며 이 방법론의 성공에 매우 중요합니다. 이 비디오에서는 이러한 중요한 단계를 자세히 보여 줍니다. 0.1 의 어금니 나트륨 cacodylate 버퍼에 샘플을 고정 한 후, 포함 2.5% 글루타랄데히드, 2 밀리몰라 칼슘 염화 칼슘, 샘플은 2 밀리미터 큐브보다 큰 블록으로 절단하고, 2 밀리알라 칼슘 클로라이드를 포함하는 0.1 어금니 질화 완충제로 세척한다.
조직은 오스뮴 페로시아니드, 티오카르보히드라지드 및 오스뮴 테트리옥사이드로 순차적으로 염색됩니다. 오스뮴 테트산화물 인큐베이션 후, 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 1%수성 우라골 아세테이트로 조직을 치료하십시오. 다음날 아침, 0.066 그램의 납 질산용액을 0.03 의 아파르트 산 용액의 10 밀리리터에 녹이고, 월튼의 납 아스파트액의 pH를 5.5로 조정하기 위해 하나의 정상 수산화 칼륨을 사용합니다.
오븐에서 용액을 데운 후, 실온, 이중 증류수에서 세척당 3분 동안 티슈를 5회 세척한 후, 조직을 60°C로 옮기고 월튼의 납 인산액을 섭씨 60도에서 30분 동안 데워버링합니다. 인큐베이션이 끝나면 조직을 씻고 차가운 아세톤 시리즈에서 탈수한 다음 실온 아세톤에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 회전 플랫폼에 4시간 동안 아세톤에 하드 혼합 수지의 1:3 비율로 조직을 배치한 다음 회전 플랫폼에서 아세톤 용액에 대한 수지의 1:1 비율로 8시간 또는 하룻밤 사이에 침투한 다음, 회전 플랫폼에서 3:1 비율로 재톤을 아세톤에 침투합니다.
다음 아침, 새로운 100%수지에서 4-8시간, 하룻밤 1회, 회전하는 플랫폼의 실온에서 4시간 동안 침투합니다. 다음 아침, 수지가 분말로 포화 될 때까지 소량의 수지와 탄소 검은 색 분말을 혼합하기 위해 나무 막대기를 사용하지만 여전히 유체이며 거칠지 않습니다. 레지던스는 두꺼운 잉크를 닮아야하며, 눈에 보이는 덩어리없이 천천히 물방울이 실리콘 고무 금형에 조직 샘플을 배치하고 수지 블록 내의 샘플 방향을 나중에 참조하기위한 이미지를 캡처 할 수 있어야합니다.
시료가 제자리에 있을 때, 실리콘 몰드 의 끝에 있는 탄소 흑색 포화 수지의 조직을 커버하고, 수지의 반대쪽 끝에 곰팡이에 실험 및 조직 세부 사항을 나타내는 라벨을 부착한다. 그런 다음 금형을 섭씨 65도 오븐에 약 1시간 동안 경사로 놓습니다. 탄소 검정 주입 된 수지가 충분히 경화되면 오븐에서 금형을 제거하고 빈 우물로 시작하여 금형의 나머지 부분을 투명 수지로 채우고 라벨이 그대로 유지되는 것을 주의하십시오.
시료가 투명한 수지로 덮여있을 때 실리콘 몰드을 경사가 아닌 섭씨 65도 오븐에 다시 넣고 48 시간 동안 금형을 제거하십시오. 이미징을 위해 블록을 준비하려면 수지 임베디드 시편을 미세토메 척에 놓고 테이퍼 엔드가 척에서 약 5~6밀리미터 튀어나와 놓습니다. 시편을 세트 나사로 제자리에 고정하고 시편을 열램프 아래에 놓습니다.
몇 분 후, 척을 스테레오 현미경 홀더에 넣고, 조직이 보일 때까지 블록 면에 평행하게 얇은 섹션을 만들기 위해 새로운 양날면도날을 사용하여 조직이 없는 수지의 부분에 비해 반사가 적고 과립이 됩니다. 트리밍 핀 홀더에 알루미늄 시편 핀을 고정하고 핀 의 얼굴에 여러 개의 깊고 교차 스크래치를 만들어 시편을 제자리에 고정하는 데 사용되는 접착제에 대한 더 큰 표면적을 제공합니다. 시편을 열램프 아래에 놓고 면도기를 1~2밀리미터 아래로 밀어 서 두 번째, 블록에 동등한 깊이의 수직 절단을 하기 전에, 블록이 높이에서 직경 이 약 3밀리미터되도록 조직 샘플에서 초과 수지를 다듬는다.
이 초기 트리밍 후, 다시 열 램프 아래 블록을 따뜻하게하고, 하나의 부드러운 컷에서 트리밍 부분 아래 약 1 밀리미터 수지 블록의 상단을 잘라 새로운 양날 면도날을 사용합니다. 절단 알루미늄 핀을 포함하는 트리밍 핀 홀더를 스테레오현미경 리셉터클에 넣고, 눈에 보이는 반월 상연을 형성하지 않고 핀을 완전히 덮도록 핀 면에 얇은 층의 시아노아크라일트 접착제를 적용합니다. 집게를 사용하여 트리밍된 조직 블록을 시편 핀 면 중앙에 몇 초 동안 누르고 접착제가 몇 분 동안 설정되도록 합니다.
접착제가 철저히 건조되면 수지 블록의 제기 된 부분에 조직을 찾아 내고 양날 면도기를 사용하여 조직 샘플을 포함하는 수지의 제기 된 부분을 1 평방 밀리미터 이하의 영역으로 다듬습니다. 천천히 조심스럽게, 가능한 한 많은 과잉 수지를 제거하고 블록을 한 차원으로 약간 더 길게 두고, 최종 금속 파일을 사용하여 핀의 가장자리를 향해 조직 샘플을 포함하는 제기 된 부분의 외부 영역에서 과도한 수지를 각도로 합니다. 준비된 시료에서 수지 입자와 먼지를 제거한 후 얇은 은페인트와 금스퍼터링을 전체 시료 블록 표면에 적용합니다.
코팅 후 블록 페이스 표면에서 여분의 실버 페인트를 다듬고, 적절한 라벨이 부착된 맞춤형 전송 파이펫 튜브의 구근 끝에 장착및 트리밍 블록을 배치합니다. SBF-SEM 이미징을 사용하여 성인 마우스 각막 내에서 엘라스틴이 없는 마이크로피브릴 번들 네트워크가 확인되었습니다. 이 네트워크는 각질 세포와 밀접하게 연관된 섬유와 함께 뚜렷한 층으로 구성되며, 심지어 각질 세포 표면의 얕은 질 내에 누워 있습니다.
이 프로토콜의 응용 프로그램은 기질 상피 국경에서 기저 상피 세포와 융합 중앙 각막 신경의 이전에 알려지지 않은 인구의 발견으로 이어졌다. 중앙 각막의 SBF-SEM 이미징은 3D 재건을 위해 수동으로 분할될 수 있는 사지 혈관, 신경 번들 및 관련 세포의 존재를 보여줍니다. 이 이미징 절차의 일부 함정에는 너무 긴 픽셀 거주 시간을 사용하여 후속 이미지가 물결 모양과 왜곡될 수 있으며, 블록 면에서 전자의 작은 방전이 발생하여 선의 급격한 대비 변화, 칼 의 가장자리에 손상된 칼 또는 파편이 축적되어 블록 면에 칼 스크래치가 급격히 변하는 것을 포함합니다. , 확장전자빔으로부터의 유물은 샘플이 이미징 챔버에 남아 있는 동안 블록 면에 초점을 맞추고, 부적절한 조직 고정, 세포 구조 및 결합 조직의 분리로 이어지는, 조직 또는 수지 블록 내에서 다량의 충전의 결과로 영상 건너뛰기.
조직 블록을 절단 할 때, 조직이 블록 내에 어디에 있는지 잘 이해하는 것이 중요합니다, 그래서 실수로 어떤 중요한 샘플 영역을 손질하지 않도록. 특정 세포 구조 또는 상호 작용의 높은 해상도 이미지가 원하는 경우, 이미징을 중단 할 수 있습니다, 현미경에서 제거 블록, 그들은 전송 전자 현미경 직렬 블록 얼굴 스캔 전자 현미경 검사전자 현미경 검사에서 볼 수있는 초미세 토메에 절단 섹션생물학적 조직의 전적으로 독특한 보기를 할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여 품질 데이터 집합을 신속하게 획득하고 탐색할 수 있는 조직의 범위를 확장할 수 있었습니다.
