シリアルブロック顔走査電子顕微鏡は、3次元組織の超構造の前例のないビューを提供し、これまで不可能または追求することが非常に困難な質問のホストに答えることができます。この技術により、組織の充電とアーティファクトを最小限に抑え、3次元データセットを迅速かつ再現可能に生産できます。そして重要なのは、毎日何千もの画像を自動的にキャプチャできることです。
標準透過電子顕微鏡は、優れた細胞超構造を提供します。しかし、これらの画像は3次元の文脈を欠いているし、解釈するのが難しい場合がある。シリアルブロック面走査電子顕微鏡は、複雑なプロセスの解釈を可能にする、その三次元的な文脈を提供する。
このプロトコルは信頼性が高く再現可能ですが、特定の手順では精度が必要であり、この方法論を成功させるためには非常に重要です。このビデオでは、これらの重要な手順を詳しく説明します。サンプルを0.1モルカコチル化ナトリウムに固定し、2.5%グルタルアルデヒドと2ミリモル塩化カルシウムを含み、試料を2ミリメートル以下のブロックに切断し、2ミリモル塩化カルシウムを含む0.1モルナトリウムカコチル酸緩衝液で洗浄する必要があります。
その後、オスミウムフェロシアン化物、チオカルボヒドラジド、および四酸化オスミウムで組織を順次染色する。四酸化オスミウムインキュベーション後、一晩摂氏4度で1%酢酸尿水酢酸の組織を治療する。翌朝、0.066グラムの硝酸鉛を0.03モルアスパラギン酸溶液の10ミリリットルに溶解し、通常の水酸化カリウム1個を使用してウォルトンの鉛アスパラギン酸溶液のpHを5.5に調整する。
オーブンで溶液を温めた後、室温、二重蒸留水で洗浄ごとに3分間組織を5回洗浄し、組織を摂氏60度に移し、ウォルトンの鉛アスパルタン溶液を摂氏60度で30分間温めます。インキュベーションの終わりに、組織を洗浄し、上昇した氷冷アセトンシリーズで脱水し、続いて室温アセトンで10分間のインキュベーションを行います。次いで、回転プラットフォーム上で4時間のアセトン中の硬混合樹脂の1:3比に組織を配置し、回転プラットフォーム上の樹脂とアセトン溶液の1:1比で8時間または一晩浸潤し、回転プラットフォーム上の樹脂とアセトンの3:1比で一晩浸潤する。
翌朝、回転プラットフォーム上の室温で1つの4〜8時間、1泊1回、および1つの4時間の浸潤のために新鮮な100%樹脂で組織を浸透させる。翌朝、少量の樹脂とカーボンブラックパウダーを混合して、樹脂が粉末で飽和するまで、木製スティックを使用しますが、まだ流動性が高く、粒状になることはありません。住居は厚いインクに似ており、目に見える塊なしでゆっくりと滴下することができ、シリコーンゴム型に組織サンプルを置き、後で樹脂ブロック内のサンプル配向を参照するための画像をキャプチャします。
試料が所定の位置にある場合、シリコーンモールドの先端にあるカーボンブラック飽和樹脂に組織を覆い、そのラベルは、樹脂の反対側端にある鋳型における実験および組織の詳細を示す。その後、約1時間の傾斜で65°Cのオーブンに金型を置きます。カーボンブラック注入樹脂が十分に硬化したら、オーブンから金型を取り出し、空の井戸から始め、残りの金型を透明な樹脂で満たし、ラベルが目に見えるままにしてください。
サンプルが透明な樹脂で覆われたら、シリコーンモールドを傾斜ではなく65°Cのオーブンに48時間戻し、金型を取り外します。イメージング用のブロックを準備するには、樹脂埋め込み標本をマイクロトームチャックに置き、テーパーエンドがチャックから約5〜6ミリメートルを突き出します。セットネジで試料を所定の位置にロックし、試料をヒートランプの下に置きます。
数分後、チャックをステレオ顕微鏡ホルダーに入れ、新しい両刃のカミソリブレードを使用して、組織が見えるまで薄い切片をブロック面に平行にします。トリミングピンホルダーにアルミニウム製の試料ピンを固定し、ピンの面にいくつかの深い十字架の傷を作り、試料を所定の位置に保持するために使用される接着剤のためのより大きな表面積を提供します。試料をヒートランプの下に置き、カミソリを樹脂ブロックに1〜2ミリメートルまっすぐに押し込んでから、ブロックに等しい深さの垂直なカットを行い、ブロックの直径が約3ミリメートル高くなるようにティッシュサンプルから余分な樹脂をトリミングします。
この最初のトリミングの後、再びヒートランプの下にブロックを温め、新しい両刃のカミソリブレードを使用して、1つの滑らかなカットでトリミングされた部分の約1ミリメートル下の樹脂ブロックの上部を切断します。切断したアルミニウムピンを含むトリミングピンホルダーを実体顕微鏡のレセプタクルに入れ、シアノアクリル酸接着剤の薄い層をピン面に塗布し、目に見える半月板を形成することなくピンを完全に覆います。鉗子を使用して、トリミングされた組織ブロックを標本ピン面の中央に数秒間押し付け、接着剤を数分間セットします。
接着剤が十分に乾燥したら、樹脂ブロックの隆起部分に組織を配置し、両刃のカミソリを使用して、組織サンプルを含む樹脂の隆起部分を1平方ミリメートル以下の領域にトリミングします。ゆっくりと慎重に、できるだけ多くの余分な樹脂を取り除き、ブロックを1次元に少し長く残し、最終的な金属ファイルを使用して、組織サンプルを含む隆起部分の外側の領域の余分な樹脂をピンの端に向かって下に傾けます。サンプルブロック表面全体に銀色塗料と金スパッタリングの薄いコートを塗布する前に、準備されたサンプルから樹脂の粒子とほこりを取り除きます。
コーティング後、ブロック面の表面から余分な銀色の塗料をトリミングし、取り付けられたトリミングされたブロックを、適切なラベルが付いたカスタムメイドの転写ピペットチューブの球根端に置きます。SBF-SEMイメージングを用いて、成人マウス角膜内でエラスチンフリーマイクロフィブリル束のネットワークが同定されている。このネットワークは、角膜細胞表面の浅い内層に横たわっている繊維が、角膜細胞と密接に関連付けられている、別個の層で組織されています。
このプロトコルの適用は、間質上皮の境界で基底上皮細胞と融合する中央角膜神経の未知の集団の発見につながっている。中央角膜のSBF-SEMイメージングは、3D再構成のために手動でセグメント化することができる四肢血管系、神経束および関連細胞の存在を明らかにする。このイメージング手順のいくつかの落とし穴には、あまりにも長いピクセル滞量時間を使用することが含まれており、その後の画像が波状に歪み、ブロック面からの電子の小さな放電、ラインの急速なコントラスト変化、ナイフの損傷によるブロック面のナイフの傷、ナイフの端に蓄積された破片によるブロック面の傷につながる可能性があります、サンプルがまだイメージングチャンバーにある間にブロック面に焦点を当てた拡張電子ビームからのアーチは、不適切な組織固定、細胞構造と結合組織の分離、および組織または樹脂ブロック内で大量の充電の結果として画像スキップを導く。
組織ブロックを切断する際には、組織がブロック内のどこにあるかをよく理解することが重要であり、重要なサンプル領域を誤ってトリミングしないようにする。特定の細胞構造または相互作用のより高い解像度の画像が望ましい場合、イメージングを停止し、ブロックを顕微鏡から取り除き、透過電子顕微鏡で見ることができる超ミクロトーム上の切片を切断することができます。このプロトコルを使用して、我々は迅速に品質データセットを取得し、我々は探求できる組織の範囲を拡大することができました。
