A microscopia eletrônica de varredura em bloco serial fornece uma visão sem precedentes das estruturas ultra-dimensionais do tecido tridimensional, e pode responder a uma série de perguntas antes impossíveis ou extremamente difíceis de perseguir. Esta técnica permite a produção rápida e reprodutível de conjuntos de dados tridimensionais com carregamento mínimo de tecido e artefatos. E, importante, permite a captura automatizada de milhares de imagens diariamente.
A microscopia eletrônica de transmissão padrão fornece excelente estrutura ultra celular. No entanto, essas imagens não têm contexto tridimensional, e podem ser difíceis de interpretar. A microscopia eletrônica de varredura em bloco serial fornece esse contexto tridimensional, permitindo a interpretação de processos complexos.
Embora este protocolo seja confiável e reprodutível, certas etapas requerem precisão e são criticamente importantes para o sucesso desta metodologia. Este vídeo demonstrará essas etapas críticas em detalhes. Após a fixação de amostras em tampão de cacodilato de sódio molar 0,1, contendo 2,5% glutaraldeído, e dois cloreto de cálcio milialar, as amostras devem ser cortadas em blocos não maiores que dois milímetros cúbicos, e lavadas com tampão de cacodila de sódio molar de 0,1 molar contendo dois cloreto de cálcio milimolar.
O tecido é então sequencialmente manchado com ferrocidato de ósmio, tiocarbohydrazida e tetroxida de ósmio. Após a incubação do tetroxida de ósmio, trate o tecido com acetato de urâncio 1%aquoso a quatro graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, dissolva 0,066 gramas de nitrato de chumbo em 10 mililitros de solução de ácido aspartc molar de 0,03 molar, e use um hidróxido de potássio normal para ajustar o pH da solução de aspartato de chumbo do Walton para 5,5.
Depois de aquecer a solução no forno, lave o tecido cinco vezes por três minutos por lavagem em temperatura ambiente, água duplamente destilada, antes de transferir o tecido para uma solução de aspartato de chumbo de 60 graus Celsius aqueceu a solução de aspartato de chumbo de Walton por 30 minutos a 60 graus Celsius. No final da incubação, lave o tecido e desidrate-o em uma série ascendente de acetona gelada, seguida de uma incubação de 10 minutos em acetona de temperatura ambiente. Em seguida, coloque o tecido em uma proporção de 1:3 de resina dura mista em acetona para quatro horas de infiltração em uma plataforma rotativa, seguido de uma infiltração de oito horas ou durante a noite em uma proporção de 1:1 de solução de resina para acetona em uma plataforma rotativa, então, uma infiltração durante a noite em uma razão de 3:1 de resina para acetona na plataforma rotativa.
Na manhã seguinte, infiltrar-se no tecido em resina fresca de 100% por uma de quatro a oito horas, uma durante a noite, e uma infiltração de quatro horas à temperatura ambiente em uma plataforma rotativa. Na manhã seguinte, use uma vara de madeira para misturar uma pequena quantidade de resina com pó preto carbono até que a resina esteja saturada com o pó, mas ainda é fluida e não se torna granulada. A residência deve se assemelhar a tinta grossa, e ser capaz de gotejar lentamente sem aglomerados visíveis Coloque a amostra de tecido em um molde de borracha de silicone, e capture uma imagem para referência posterior da orientação da amostra dentro do bloco de resina.
Quando a amostra estiver no lugar, cubra o tecido da resina saturada preta de carbono na ponta do molde de silicone, com o rótulo indicando os detalhes experimentais e teciduais no molde na extremidade oposta da resina. Em seguida, coloque o molde em um forno Celsius de 65 graus em uma inclinação por aproximadamente uma hora. Quando a resina infundida preta de carbono tiver curado suficientemente, remova o molde do forno e, começando com um poço vazio, encha o restante do molde com resina clara, tomando cuidado para que o rótulo permaneça visível.
Quando a amostra estiver coberta com resina clara, coloque o molde de silicone de volta no forno Celsius de 65 graus, não em uma inclinação, por 48 horas, depois remova o molde. Para preparar o bloco para a imagem, coloque a amostra embutida de resina em um mandril de microtómeo com a extremidade afilada furando aproximadamente cinco a seis milímetros do mandril. Bloqueie a amostra no lugar com o parafuso definido e coloque a amostra sob uma lâmpada de calor.
Depois de vários minutos, coloque o mandril em um suporte de microscópio estéreo, e use uma nova lâmina de barbear de dois gumes para fazer seções finas paralelas à face do bloco até que o tecido seja visível, que será menos reflexivo e granular em comparação com as porções da resina que são desprovidas de tecido. Fixar um pino de alumínio no suporte do pino de corte, e fazer vários arranhões profundos e cruzados na face do pino para fornecer uma área de superfície maior para a cola usada para manter o espécime no lugar. Coloque a amostra sob uma lâmpada de calor, e empurre a navalha de uma a duas milímetros direto para baixo no bloco de resina antes de fazer um segundo corte perpendicular de igual profundidade no bloco, para cortar o excesso de resina da amostra de tecido para que o bloco seja de aproximadamente três milímetros de diâmetro por dois a três milímetros de altura.
Após este corte inicial, aqueça o bloco sob a lâmpada de calor novamente, e use uma nova lâmina de barbear de dois gumes para cortar a parte superior do bloco de resina cerca de um milímetro abaixo da porção aparada em um único corte suave. Coloque o suporte do pino de corte, contendo o pino de alumínio cortado, no recipiente de estereomicroscópio, e aplique uma fina camada de cola cianoacrilato na face do pino de tal forma que cubra completamente o pino sem formar um menisco visível. Use fórceps para pressionar o pedaço de tecido aparado no centro da face do pino da amostra por vários segundos, e deixe a cola definir por vários minutos.
Quando a cola estiver completamente seca, localize o tecido na porção levantada do bloco de resina e use uma navalha de dois gumes para aparar a porção levantada da resina contendo a amostra de tecido em uma área não maior que um milímetro quadrado. Devagar e com cuidado, remova o máximo de excesso de resina possível, deixando o bloco um pouco mais longo em uma dimensão, e use um arquivo de metal final para angular o excesso de resina na área fora da porção levantada contendo a amostra de tecido em direção à borda do pino. Remova partículas de resina e poeira da amostra preparada antes de aplicar uma fina camada de tinta prateada e sputtering de ouro em toda a superfície do bloco de amostra.
Após o revestimento, corte qualquer tinta de prata em excesso das superfícies faciais do bloco e coloque o bloco montado e aparado na extremidade bulbosa de um tubo de pipeta de transferência personalizado com a etiqueta apropriada anexada. Usando imagens SBF-SEM, uma rede de pacotes de microfibril sem elastina foram identificados dentro da córnea do rato adulto. Esta rede é organizada em camadas distintas, com as fibras intimamente associadas com ceratocitos, mesmo deitadas dentro de invaginações rasas na superfície do queatocito.
A aplicação deste protocolo levou à descoberta de uma população até então desconhecida de nervos córneas centrais que se fundem com células epiteliais basais na fronteira estromal-epitelial. A imagem SBF-SEM da córnea central revela a presença de vasculatura limbal, feixes nervosos e células associadas que podem ser segmentadas manualmente para reconstrução 3D. Algumas armadilhas deste procedimento de imagem incluem o uso de um tempo de moradia de pixel muito longo, o que pode fazer com que imagens subsequentes sejam onduladas e distorcidas, pequenas descargas de elétrons da face do bloco, levando a mudanças rápidas de contraste nas linhas, arranhões de faca na face do bloco devido a uma faca danificada ou acúmulo de detritos na borda da faca , artefatos de um feixe de elétrons estendidos se concentram na face do bloco enquanto a amostra ainda está na câmara de imagem, fixação inadequada de tecido, levando à separação de estruturas celulares e tecido conjuntivo, e pular imagem como resultado de uma grande quantidade de carregamento dentro do tecido ou bloco de resina.
Ao cortar o bloco tecidual, é importante ter uma boa compreensão de onde o tecido está dentro do bloco, de modo a não cortar acidentalmente nenhuma região amostral importante. Se forem desejadas imagens de maior resolução de estruturas ou interações celulares específicas, a imagem pode ser interrompida, o bloco removido do microscópio e seções cortadas em um ultramicrotome onde podem ser vistas em um microscópio eletrônico de transmissão A microscopia eletrônica de varredura de rosto de bloco serial permite uma visão totalmente única dos tecidos biológicos. Usando este protocolo, conseguimos rapidamente adquirir conjuntos de dados de qualidade e expandir a gama de tecidos que podemos explorar.
