Este protocolo detalla el método de microscopía de expansión de ultraestructura en tres etapas del ciclo de vida in vitro de Trypanosoma cruzi, el patógeno responsable de la enfermedad de Chagas. Este protocolo ofrece una alternativa a las técnicas actuales de imágenes de súper resolución y microscopía electrónica, con la ventaja de ser compatible con los microscopios convencionales que se encuentran en la mayoría de los laboratorios de biología y en las instalaciones de las máquinas. Utiliza técnicas comunes para la mayoría de los laboratorios de investigación para obtener imágenes que permiten la reconstrucción tridimensional.
El protocolo facilita el estudio de estructuras a nanoescala en tripanosomátidos, permitiendo la inspección de una población de células y la obtención de imágenes de todo el volumen de una célula de interés a alta resolución. Es particularmente útil para tipos de células específicos de la ciencia en fases transitorias del ciclo celular y la diferenciación. Para ganar aún más resolución, utilizaremos la combinación de ExM con técnicas microscópicas de súper resolución para alcanzar resoluciones inferiores a 20 nanómetros.
Comience preparando la suspensión de epimastigote de Trypanosoma cruzi a partir de un cultivo en fase logarítmica en medio LIT suplementado con 10% de FCS. Centrifugar la suspensión a 5.000 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Lave el pellet dos veces con PBS, luego vuelva a suspender en 200 microlitros de PBS.
Adherir la suspensión a un cubreobjetos redondo de 12 milímetros recubierto con Poly-D-lisina e incubarlo a temperatura ambiente durante 15 a 20 minutos antes de prevenir la reticulación. Recoja el sobrenadante de una monocapa de células Vero infectadas con los tripomastigotes cuatro días después de la infección. Utilizando una cámara de recuento de células de Neubauer, determine la concentración de los tripomastigotes.
Centrifugar la suspensión celular a 7.000 G durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de enjuagar y resuspender las células en PBS, transfiera la suspensión de la célula a un cubreobjetos recubierto de lisina e incube el cubreobjetos a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos antes de la prevención de la reticulación. Para obtener amastigotes de células Vero infectadas, coloque un cubreobjetos redondo estéril de 12 milímetros en la parte inferior de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos.
A continuación, prepare una suspensión de células Vero en DMEM suplementada con 2%FCS, y siembre 500 microlitros de la suspensión en cada pocillo. Incubar la placa durante la noche para asegurar la adhesión de las células. A continuación, lavar las células dos veces con 500 microlitros de PBS estéril.
Agregue tripomastigotes de T. cruzi en las células e incube como antes durante seis horas. Comience agregando 0.5 mililitros de solución de prevención de reticulación a cada pocillo de una placa de 24 pocillos. A continuación, sumerja los cubreobjetos de 12 milímetros recubiertos de poli-D-lisina con parásitos adherentes.
Después de llenar los pozos vacíos con agua para reducir la evaporación, selle la placa con una película de sellado e incube. Para gelificar las muestras, primero ensamble una cámara húmeda en una placa de Petri colocando una película de sellado sobre papel de seda. Luego, humedece el papel de seda con agua e incuba a menos 20 grados centígrados durante 20 minutos para que se enfríe.
Coloque la cámara fría y húmeda sobre hielo. A continuación, con una pipeta Pasteur de tres mililitros, aspire la solución de prevención de reticulación de los pocillos de la placa de 24 pocillos. Ahora, usa unas pinzas para quitar los cubreobjetos y colócalos sobre el papel de seda con los parásitos hacia arriba.
Tome 90 microlitros de solución monomérica en un tubo y agregue cinco microlitros de TEMED descongelado y APS. Agita la mezcla durante dos o tres segundos. Pipetee 35 microlitros de esta mezcla sobre la película de sellado para cada cubreobjetos, e inmediatamente use pinzas para colocar los cubreobjetos sobre la gota con los parásitos hacia abajo.
Incubar la cámara húmeda en hielo durante cinco minutos, luego a 37 grados centígrados durante una hora. Comience pipeteando dos mililitros de solución de desnaturalización en cada pocillo de una placa de seis pocillos. Transfiera los cubreobjetos gelificados que contienen parásitos Trypanosoma cruzi a la solución de desnaturalización e incube con una agitación suave.
Para favorecer el desprendimiento del gel. Con una espátula de metal, transfiera con cuidado el gel a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga un mililitro de la solución de desnaturalización. Incube el tubo con una tapa asegurada en un bloque calefactor.
Utilice una pipeta P1000 para aspirar la solución de desnaturalización de los tubos de microcentrífuga. Con una espátula de metal, transfiera el gel a una placa de Petri que contenga 10 mililitros de agua ultrapura y déjelo durante 30 minutos. Con una pipeta Pasteur desechable de tres mililitros, reemplace el agua ultrapura en el plato, dejando el gel sumergido durante la noche a temperatura ambiente.
Al día siguiente, mida el diámetro del gel con un calibrador para calcular la expansión. Las muestras eran visibles como un gel plano y translúcido que se expandía de 4 a 4,5 veces en el agua. Comience el etiquetado fluorescente lavando los círculos de gel expandidos que contienen los parásitos con PBS.
Usa una cuchilla de afeitar para cortar los círculos del centro en cuadrados de 10 por 10 milímetros. Ahora, transfiera cada cuadrado a una placa de 12 pocillos e incube en 500 microlitros del anticuerpo primario diluido en 2% PBS y BSA, con agitación. A continuación, incubar los cuadrados de gel en una placa de seis pocillos que contenga dos mililitros de PBS con 0,1% de polisorbato 20 durante 10 minutos, con agitación.
Después de transferir el gel a una placa de 12 pocillos, agregue 500 microlitros de anticuerpo secundario en PBS con DAPI y 10 microgramos por mililitro de éster NHS conjugado con el fluoróforo deseado. Incubar el gel durante 2,5 horas a 37 grados centígrados bajo una suave agitación. Después de lavar el gel tres veces en polisorbato PBS 20 como antes, transfiera el gel a una placa de Petri con agua ultrapura e incube durante 30 minutos.
Coloque un cuadrado de 10 por 10 milímetros de la pieza de gel expandido en un plato inferior de 35 milímetros. Compruebe la orientación de los parásitos con un aumento de 10 o 20X. Visualice las muestras en un microscopio confocal con un objetivo de inmersión en aceite de 63X, con una apertura numérica de 1,4.
Adquiera pilas Z, el ancho de cada paso Z y el tiempo de exposición por píxel determinado empíricamente, luego adquiera la intensidad de la señal y la optimización de los tiempos de adquisición utilizando el zoom de escaneo para una ampliación efectiva, si lo desea. Abra la pila Z con un software de procesamiento de imágenes y agrupe las imágenes apiladas utilizando la opción de proyecto de grupo Z para cada canal. A continuación, seleccione la proyección de intensidad máxima.
Combine imágenes con la herramienta Fusionar canales. Seleccione el color de cada canal y agregue la barra de escala usando la herramienta Barra de escala en el software de procesamiento. La expansión primaria proporcionó una resolución efectiva de 70 nanómetros, mientras que la expansión secundaria mostró factores de expansión de alrededor de 4,5.
La tinción de las tres etapas del ciclo de vida in vitro de T. cruzi con marcadores citoesqueléticos mostró la localización del corsé microtubular y el axonema flagelar de la proteína. La condensación de la cromatina se distinguió claramente cuando se tiñó con DAPI. La inmunolocalización de los marcadores de alfa tubulina superpuesta con el marcaje del panproteoma en epimastigotes mostró que el cuerpo basal teñido con anti-alfa-tubulina y FITC se había dividido.
El marcaje del proteoma Pan ayudó a identificar diferentes estructuras de parásitos en todas las etapas del ciclo de vida.
