El movimiento dental ortodóncico es un proceso biológico complejo que implica fuerzas externas y remodelación de tejidos blandos y duros. Para entender estos procesos, es fundamental estudiar el diente y los tejidos periodontales dentro del contexto 3D. El modelo murino es un buen candidato para este tipo de estudios debido a su tamaño, alta tasa metabólica y la vasta información genética que tenemos.
Sin embargo, crear movimiento dental de ortodoncia en ratones no es fácil debido a su pequeño tamaño. Además, los métodos de análisis estructural generalmente implican seccionamiento, lo que interrumpe la estructura 3D y el contexto del tejido. Para un tejido no uniforme, como la PDL, preservar la estructura y el contexto 3D es de una importancia crítica.
Para abordar estos dos obstáculos, proporcionamos un protocolo para generar el movimiento ortodóncico mesial del diente de la primera muela mandibular en ratones y describimos dos métodos que permiten la visualización 3D del ligamento periodontal sin sececcionar el tejido. Para colocar el ratón anestesiado para la inserción del dispositivo de ortodoncia, enganche el incisivo superior al bucle de clip de papel. Inmovilizar los incisivos inferiores utilizando la cadena de alimentación Y abrir la boca aún más con retractor de ratón mini-colibri.
Aplique una pequeña gota de solución salina en cada ojo para prevenir la deshidratación corneal. Estas son las herramientas utilizadas en la inserción de dispositivos. Corte un pedazo de alambre de aluminio a un centímetro de longitud.
Usando el porta agujas microquirúrgicas, deslice el alambre desde el lado bucal lingualmente en el área interproximal debajo del punto de contacto entre el primer y segundo molar. Tire del alambre desde el lado lingual hacia el lado mesial del molar. Gire los extremos libres del cable de dos a tres veces para asegurar.
Corte un pedazo de titanio de níquel o resorte helicoidal NiTi alrededor de siete a nueve hilos de longitud. Inserte la bobina entre el primer molar inferior y el incisivo, pase un extremo libre del alambre a través de dos hilos de la bobina, luego gire ambos extremos del alambre firmemente para fijar la bobina al molar. Retire la cadena de alimentación con un par de pinzas.
Coloque de dos a tres hilos de la bobina sobre el incisivo para anclar la bobina. Deje exactamente tres hilos activos entre el primer molar y el incisivo. Deslice las amenazas hacia abajo hasta el margen gingival libre de incisivos.
Coloque una capa de resina compuesta fluible en el borde incisal de la bobina y cúrtela con luz de curado dental. Substituya la cadena de alimentación después de curar la resina. Recorte el exceso de alambre alrededor del molar para evitar lesiones.
Usando la misma luz de curado, caliente la bobina de NiTi durante 20 segundos. Esto apretará la bobina, la colocación terminada debería verse así. El tejido blando en la mandíbula hemi diseccionada se puede eliminar con una toallita sin pelusas.
Con una muestra entre dos dedos, frote el exterior en movimiento circular hasta que se elimine la mayor parte del tejido blando. El resto se puede cortar con un par de tijeras. La mandíbula limpia se muestra aquí a la derecha.
Para montar la mandíbula hemi diseccionada en la cámara de muestra de la tomografía computarizada micro, dé forma a una resina dental empacanable del tamaño de un grano de arroz en un tronco. A continuación, colócelo en la ranura de muestra del escenario. Coloque la hemi-mandíbula sobre el compuesto.
Ajuste la posición hasta que el primer molar esté centrado en la ranura de la línea media y la superficie oclusal sea horizontal. Cure el compuesto cuando esté satisfecho con el posicionamiento. Este es un ejemplo de la mandíbula en la posición adecuada.
Tome una pequeña bola de resina dental empacable. Su diámetro debe estar alrededor de la anchura del molar. Coloque la resina sobre la superficie oclusal del primer molar.
Humede la toallita sin pelusas con agua. Coloque la toallita humedeceda dentro de las piscinas de humedad en la etapa de muestra. Cierre la cámara de muestra y consívela a la micro TC con tornillos.
Ahora tome imágenes 2D mientras baja el yunque verticalmente hasta que la punta del yunque esté rodeada por el compuesto. Apague de forma segura la fuente de rayos X, abra la cámara de micro TC y cure el compuesto a través de la ventana de plexiglás transparente. Ahora la muestra está montada correctamente y se puede obtener una imagen según sea necesario.
Para generar una muestra de hemi-mandíbula ópticamente despejada, prepare las siguientes soluciones en tubos centrífugos de 1,5 mil. 4%paraformadehído, 50% y 70% etanol en agua desionizada. Dos tubos de etanol al 100% y cinamato etílico.
Coloque la hemi-mandíbula disecada en paraformadehído al 4%. Cubra el tubo con papel de aluminio y colóquelo en un balancín en un ajuste suave durante seis horas a temperatura ambiente. Después de seis horas, transfiera la muestra al 50% de etanol.
Coloque la muestra de nuevo en el balancín durante 16 horas cubierto de luz. Repita el paso anterior con una muestra en etanol al 70% durante 16 horas seguida de etanol al 100% dos veces durante 16 horas cada vez. Finalmente mover la muestra a cinamato etílico durante un mínimo de 12 horas.
El movimiento ortodóntico confiable es generado por el dispositivo de la bobina de NiTi en la primera muela de la mandíbula murine. En ratones machos de nueve semanas de edad, el espacio interproximal promedio es de 40 micras después de siete días. La mejora de fase micro CT permite la visualización de la PDL.
Después de tres días de movimiento ortodóncico mesial, la densidad de PDL se reduce. La interfaz pdl ósea es más áspera debido al desarrollo de cráteres en la superficie ósea, que son indicativos de la actividad osteoclástica y la resorción ósea. La superficie rugosa se puede ver en todos los niveles de las raíces.
Esto muestra que el movimiento es traslacional en oposición a un movimiento de inclinación. En el día siete, el espacio de PDL es más estrecho que en el día tres y la frontera del hueso PDL en la superficie distal de la raíz es más lisa que son muestras de la oposición del hueso como se esperaba cuando ocurre el movimiento ortodóntico del diente. Debido al largo tiempo de imagen micro CT y la rotación de la etapa, el montaje seguro de la muestra es esencial.
Muestra inestable donde se produce escaneos borrosos donde se puede ver una silueta alrededor de la corona y no se ven las fibras PDL. El claro óptico con cinnamato de etilo proporciona otro método para ver la PDL sin seccionamiento. El sustrato se puede ver a través del ramus de una muestra adecuadamente despejada que se muestra aquí a la derecha.
Este método, preserva la fluorescencia endógena y se puede utilizar sin fijación química. La microscopía de hoja de luz se puede utilizar en muestras despejadas. Con un ratón transgénico, se pueden observar los revestimientos de los vasos sanguíneos fluorescentes.
Si el hueso no fue despejado correctamente, los vasos sanguíneos en el PDL no son visibles como se muestra en el panel F.This protocolo describió cómo superar dos desafíos importantes en la generación y el análisis del movimiento ortodóntico del diente en dientes molares de la mandíbula murine. Una vez dominada la técnica de movimiento dental de ortodoncia, se puede completar en 15 minutos. Este proceso es un reto debido a las pequeñas dimensiones de los dientes de ratón y la presencia de la lengua.
Sin embargo, proporcionamos todas las soluciones necesarias para superar estos desafíos. La proyección de imagen micro del CT requiere una capacidad del realce de la fase. Demostramos nuestra técnica usando un CT micro del banco. Sin embargo, cualquier configuración que pueda generar una mejora de fase hará, por ejemplo, un sincrotrón.
Los resultados de la limpieza de ECi dependen del proceso de deshidratación. Si la muestra no es lo suficientemente transparente, nuestra sugerencia es aumentar el tiempo de los pasos de deshidratación. Nuestro método de limpieza también se puede utilizar en muestras no fijadas.
Los tejidos claros se pueden escanear en la micro TC ya que el proceso de limpieza no afecta el contenido mineral del tejido. Por lo tanto, nuestro método proporciona un enfoque correlativo para la fluorescencia y la información estructural para generar un análisis 3D completo.
