우리는 매우 공격적인 형태의 원발성 유방암인 염증성 유방암 환자에서 추출한 세포주(IBC)를 사용하여 마우스 모델에서 뇌 전이를 생성하기 위해 꼬리 정맥 방법을 활용했습니다. 마우스 모델에서 뇌 전이의 생성은 전형적으로 심장 내 또는 경동맥 내 주사를 포함한다. 그러나 꼬리 정맥 방법은 뇌 전이 집락 단계를 더 잘 모방하고 수행하기가 비교적 간단하기 때문에 이러한 기술에 비해 이점을 제공합니다.
내 실험실의 강사 인 Xiaoding Hu와 Emilly Villodre 박사가 절차를 시연 할 것입니다. 종양 세포 주입 후 8-10 주 후에 GFP 영상으로 뇌 전이를 감지하려면 마우스를 70 % 에탄올로 소독하고 머리와 귀에서 털을 제거하십시오. 목의 자궁 경부를 자릅니다.
뇌를 채취 할 수 있도록 두개골을 절제하고 제거하십시오. 뇌를 조직 카세트에 넣고 카세트를 차가운 DPBS 용기에 1시간 이상 넣지 마십시오. 입체 현미경으로 이미징하려면 자외선이 장착된 실체 현미경으로 뇌를 100cm 조직 접시 뚜껑에 옮기고 0.5x 대물렌즈를 선택하여 전체 뇌를 시각화할 수 있습니다.
라이브 뷰를 누르고 초점을 맞춥니다 view 뇌가 복부 위치에 있는 동안. 소프트웨어와 현미경에서 세포의 형광 마커에 적합한 필터를 선택하고 사진을 찍습니다. 샘플을 이동하지 않고 명시야 영상으로 전환하고 명시야 필터를 선택합니다.
사진을 찍습니다. 그런 다음 앞에서 설명한 것처럼 등쪽 위치에 있는 뇌를 이미지화합니다. 전체 뇌 이미지를 분석하려면 먼저 이미지 파일을 TIFF에서 JPEG로 변환하여 관련 소프트웨어가 없는 컴퓨터에서 열 수 있도록 합니다.
그런 다음 한 쌍의 명시야 및 형광 이미지를 열고 파일 및 병합 채널을 선택합니다. 적절한 구성 요소를 선택하고 확인을 클릭한 다음 병합된 이미지를 저장합니다. 형광 이미지에서 뇌종양 영역을 정량화하려면 자동 선택을 선택합니다.
화살표를 GFP 위치 영역으로 이동하고 클릭하면 선택 항목이 자동으로 생성됩니다. 그런 다음 다시 클릭하여 선택을 확인합니다. 모든 측정값이 표시됩니다.
하나 이상의 GFP 양성 영역이 관찰될 수 있는 경우, 다음 영역과 측정을 반복한다. 뇌 전이성 병변은 루시페라아제 이미징 및 입체 형광 현미경으로 주사 후 빠르면 8주 이내에 감지할 수 있습니다. 이미징 후, 뇌 전이의 일부를 포르말린으로 고정하고 헤마톡실린 및 에오신 염색을 위해 처리하여 뇌 전이 병변의 존재를 검증하고 면역조직화학적 염색을 통해 관심 있는 특정 단백질 마커를 검출할 수 있습니다.
이 프로토콜을 시도할 때, 세포를 1시간 이상 얼음 위에 유지하지 않음으로써 세포 생존율을 유지하고, 색전 형성 및 마우스 사망을 방지하기 위해 세포 현탁액에서 기포를 피하는 것이 중요합니다. 꼬리 정맥 주사 후 루시페라아제 이미징으로 뇌 전이 성장과 진행을 모니터링합니다. 안락사 후 입체 형광 현미경 검사와 조직학적으로 전이 병변이 확인되었습니다.
