Nous avons utilisé la méthode de la veine de la queue pour générer des métastases cérébrales dans des modèles murins utilisant des lignées cellulaires dérivées de patientes atteintes d’un cancer inflammatoire du sein, ou IBC, une forme très agressive de cancer du sein primitif. La génération de métastases cérébrales dans des modèles murins implique généralement des injections artérielles intracardiaques ou intracarotidiennes. Cependant, la méthode de la veine de la queue offre un avantage par rapport à ces techniques car elle imite mieux les étapes de la colonisation des métastases cérébrales et est relativement simple à réaliser.
Les docteurs Xiaoding Hu et Emilly Villodre, tous deux instructeurs dans mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour détecter les métastases cérébrales par imagerie GFP huit à 10 semaines après l’injection de cellules tumorales, désinfectez la souris avec de l’éthanol à 70% et retirez la fourrure de la tête et des oreilles. Coupez la région cervicale du cou.
Excise et retirez le crâne pour permettre au cerveau d’être récolté. Placez le cerveau dans une cassette de tissu et placez la cassette dans un récipient de DPBS froid pendant pas plus d’une heure. Pour l’imagerie par stéréomicroscopie, transférer le cerveau dans un couvercle de tissu de 100 centimètres sous un stéréomicroscope équipé d’une lumière UV et sélectionner l’objectif 0,5x pour permettre la visualisation de l’ensemble du cerveau.
Appuyez sur la vue en direct et concentrez-la pendant que le cerveau est en position ventrale. Sélectionnez le filtre approprié dans le logiciel et le microscope pour le marqueur fluorescent dans les cellules, et prenez une photo. Sans déplacer l’échantillon, passez à l’imagerie en fond clair et sélectionnez le filtre de fond clair.
Prenez une photo. Ensuite, imagez le cerveau en position dorsale comme démontré précédemment. Pour analyser les images du cerveau entier, convertissez d’abord les fichiers image de TIFF en JPEG afin qu’ils puissent être ouverts avec n’importe quel ordinateur qui ne dispose pas du logiciel associé.
Ensuite, ouvrez une paire d’images en fond clair et fluorescentes et sélectionnez Fichier et fusionner les canaux. Sélectionnez les composants appropriés, cliquez sur OK et enregistrez l’image fusionnée. Pour quantifier la zone de tumeur cérébrale dans l’image fluorescente, sélectionnez la sélection automatique.
Déplacez la flèche vers la zone de position GFP et cliquez pour créer une sélection automatiquement. Cliquez ensuite à nouveau pour confirmer la sélection. Toutes les mesures seront affichées.
Si plus d’une zone positive à la GFP peut être observée, répétez la mesure avec la zone suivante. Les lésions métastatiques cérébrales peuvent être détectées dès huit semaines après l’injection par imagerie par luciférase et microscopie stéréo-fluorescente. Après l’imagerie, des parties des métastases cérébrales peuvent être fixées au formol et traitées pour la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine afin de valider la présence de lésions de métastases cérébrales, et pour la coloration immunohistochimique afin de détecter des marqueurs protéiques spécifiques d’intérêt.
Lors de l’essai de ce protocole, il est important de maintenir la viabilité cellulaire en gardant les cellules sur la glace pendant pas plus d’une heure, et d’éviter les bulles d’air dans la suspension cellulaire pour prévenir la formation d’embolies et la mortalité des souris. Après l’injection de la veine de la queue, nous surveillons la croissance et la progression des métastases cérébrales avec l’imagerie de la luciférase. Après euthanasie, la microscopie stéréo-fluorescente et l’histologie ont confirmé les lésions de métastases.
