Utilizamos o método da veia caudal para gerar metástases cerebrais em modelos de camundongos usando linhagens celulares derivadas de pacientes com câncer de mama inflamatório, ou IBC, uma forma altamente agressiva de câncer de mama primário. A geração de metástases cerebrais em modelos de camundongos tipicamente envolve injeções arteriais intracardíacas ou intracarotídeas. No entanto, o método da veia caudal oferece vantagem sobre essas técnicas, pois imita melhor as etapas da colonização de metástases cerebrais e é relativamente simples de executar.
Os médicos Xiaoding Hu e Emilly Villodre, ambos instrutores em meu laboratório, demonstrarão o procedimento. Para detectar metástases cerebrais por imagem de GFP oito a 10 semanas após a injeção de células tumorais, desinfete o camundongo com etanol a 70% e remova o pelo da cabeça e das orelhas. Corte a área cervical do pescoço.
Excise e remova o crânio para permitir que o cérebro seja colhido. Coloque o cérebro em um de tecido e coloque o em um recipiente de DPBS frio por não mais do que uma hora. Para obtenção de imagens por microscopia estéreo, transfira o cérebro para uma tampa de prato de tecido de 100 centímetros sob um microscópio estéreo equipado com uma luz UV e selecione a objetiva de 0,5x para permitir a visualização de todo o cérebro.
Pressione a visualização ao vivo e concentre a visão enquanto o cérebro está na posição ventral. Selecione o filtro apropriado no software e no microscópio para o marcador fluorescente nas células e tire uma foto. Sem mover a amostra, alterne para imagens de campo brilhante e selecione o filtro de campo brilhante.
Tire uma foto. Em seguida, imagine o cérebro na posição dorsal, como demonstrado anteriormente. Para analisar as imagens de todo o cérebro, primeiro converta os arquivos de imagem de TIFF para JPEG para que eles possam ser abertos com qualquer computador que não tenha o software associado.
Em seguida, abra um par de imagens de campo brilhante e fluorescentes e selecione os canais de arquivo e mesclagem. Selecione os componentes adequados, clique em OK e salve a imagem mesclada. Para quantificar a área do tumor cerebral na imagem fluorescente, selecione a seleção automática.
Mova a seta para a área de posição GFP e clique para criar uma seleção automaticamente. Em seguida, clique novamente para confirmar a seleção. Todas as medidas serão mostradas.
Se mais de uma área positiva para GFP puder ser observada, repita a medida com a área subsequente. Lesões metastáticas cerebrais podem ser detectadas oito semanas após a injeção por imagem de luciferase e microscopia de fluorescência estéreo. Após exames de imagem, porções das metástases cerebrais podem ser fixadas em formalina e processadas para coloração de hematoxilina e eosina para validar a presença de lesões de metástases cerebrais e para coloração imuno-histoquímica para detectar marcadores proteicos específicos de interesse.
Ao tentar este protocolo, é importante manter a viabilidade celular, mantendo as células no gelo por não mais do que uma hora, e evitar bolhas de ar na suspensão celular para evitar a formação de êmbolos e mortalidade em camundongos. Após a injeção da veia caudal, monitoramos o crescimento e a progressão das metástases cerebrais com imagens de luciferase. Após a eutanásia, microscopia de fluorescência estéreo e histologia confirmaram lesões metastáticas.
