İnflamatuar meme kanseri veya IBC'li hastalardan elde edilen hücre dizilerini kullanarak fare modellerinde beyin metastazı oluşturmak için kuyruk damarı yöntemini kullandık. Fare modellerinde beyin metastazı oluşumu tipik olarak intrakardiyak veya intrakarotis arteriyel enjeksiyonları içerir. Bununla birlikte, kuyruk damarı yöntemi, beyin metastazı kolonizasyon adımlarını daha iyi taklit ettiği ve gerçekleştirilmesi nispeten basit olduğu için bu tekniklere göre avantaj sunar.
Her ikisi de laboratuvarımda eğitmen olan doktorlar Xiaoding Hu ve Emilly Villodre prosedürü gösterecek. Tümör hücresi enjeksiyonundan sekiz ila 10 hafta sonra GFP görüntüleme ile beyin metastazlarını tespit etmek için, fareyi% 70 etanol ile dezenfekte edin ve kürkü baş ve kulaklardan çıkarın. Boynun servikal bölgesini kesin.
Beynin alınmasına izin vermek için kafatasını çıkarın ve çıkarın. Beyni bir doku kasetine yerleştirin ve kaseti bir saatten fazla olmamak üzere soğuk DPBS kabına yerleştirin. Stereo mikroskopi ile görüntüleme için, beyni UV ışığı ile donatılmış bir stereo mikroskop altında 100 santimetrelik bir doku kabı kapağına aktarın ve tüm beynin görselleştirilmesine izin vermek için 0.5x objektifi seçin.
Canlı görüntüye basın ve beyin ventral pozisyondayken görüntüye odaklanın. Hücrelerdeki floresan işaretleyici için yazılımda ve mikroskopta uygun filtreyi seçin ve bir resim çekin. Örneği hareket ettirmeden parlak alan görüntülemeye geçin ve parlak alan filtresini seçin.
Bir fotoğraf çekin. Daha sonra beyni daha önce gösterildiği gibi sırt pozisyonunda görüntüleyin. Tüm beyin görüntülerini analiz etmek için, önce görüntü dosyalarını TIFF'den JPEG'e dönüştürün, böylece ilgili yazılıma sahip olmayan herhangi bir bilgisayarla açılabilirler.
Ardından, bir çift parlak alan ve floresan görüntü açın ve kanalları dosyala ve birleştir'i seçin. Uygun bileşenleri seçin, Tamam'ı tıklatın ve birleştirilmiş görüntüyü kaydedin. Floresan görüntüdeki beyin tümörü alanını ölçmek için otomatik seçimi seçin.
Oku GFP konum alanına taşıyın ve otomatik olarak bir seçim oluşturmak için tıklayın. Ardından seçimi onaylamak için tekrar tıklayın. Tüm ölçümler gösterilecektir.
Birden fazla GFP pozitif alanı gözlemlenebiliyorsa, ölçümü sonraki alanla tekrarlayın. Beyin metastatik lezyonları, lusiferaz görüntüleme ve stereo floresan mikroskobu ile enjeksiyondan sekiz hafta sonra tespit edilebilir. Görüntülemeden sonra, beyin metastazlarının bölümleri, beyin metastazı lezyonlarının varlığını doğrulamak için hematoksilen ve eozin boyaması ve ilgilenilen spesifik protein belirteçlerini saptamak için immünohistokimyasal boyama için formalin ile sabitlenebilir ve işlenebilir.
Bu protokolü denerken, hücreleri bir saatten fazla buz üzerinde tutmayarak hücre canlılığını korumak ve emboli oluşumunu ve fare ölümünü önlemek için hücre süspansiyonunda hava kabarcıklarını önlemek önemlidir. Kuyruk veni enjeksiyonunu takiben, lusiferaz görüntüleme ile beyin metastazı büyümelerini ve ilerlemesini izliyoruz. Ötenazi sonrası stereo floresan mikroskopi ve histoloji metastaz lezyonlarını doğruladı.
