尾静脈法を用いて、炎症性乳がん(IBC)の患者由来の細胞株(原発性乳がんの侵攻度が高い)を用いて、マウスモデルに脳転移を作製しました。マウスモデルにおける脳転移の発生には、通常、心臓内または頸動脈内動脈注射が含まれます。ただし、尾静脈法は、脳転移のコロニー形成のステップをよりよく模倣し、比較的簡単に実行できるため、これらの手法よりも優れています。
私の研究室のインストラクターであるXiaoding Hu医師とEmilly Villodre医師が手順を実演します。腫瘍細胞注入後8〜10週間でGFPイメージングで脳転移を検出するには、マウスを70%エタノールで消毒し、頭と耳から毛皮を取り除きます。首の頸部を切ります。
頭蓋骨を切除して取り除き、脳を採取できるようにします。脳をティッシュカセットに入れ、カセットを冷たいDPBSの容器に1時間以内入れます。実体顕微鏡によるイメージングでは、UV光を備えた実体顕微鏡下で100センチメートルの組織皿の蓋に脳を移し、0.5倍の対物レンズを選択して脳全体を視覚化できるようにします。
ライブビューを押して、脳が腹側位置にある間にビューに焦点を合わせます。細胞内の蛍光マーカーに適したフィルターをソフトウェアと顕微鏡で選択し、写真を撮ります。サンプルを移動せずに、明視野イメージングに切り替えて明視野フィルターを選択します。
写真を撮ります。次に、前に示したように、背側の位置で脳を画像化します。脳全体の画像を分析するには、まず画像ファイルをTIFFからJPEGに変換して、関連するソフトウェアがないコンピューターで開くことができるようにします。
次に、明視野画像と蛍光画像のペアを開き、ファイルを選択してチャンネルをマージします。適切なコンポーネントを選択し、[OK]をクリックして、マージされた画像を保存します。蛍光画像で脳腫瘍領域を定量化するには、自動選択を選択します。
矢印をGFP位置領域に移動してクリックすると、選択範囲が自動的に作成されます。次に、もう一度クリックして選択を確定します。すべての測定値が表示されます。
複数のGFP陽性領域が観察される場合は、次の領域で測定を繰り返します。脳転移性病変は、ルシフェラーゼイメージングと実体蛍光顕微鏡によって注射後8週間という早い時期に検出できます。イメージング後、脳転移の一部をホルマリン固定し、ヘマトキシリンおよびエオジン染色のために処理して脳転移病変の存在を検証し、免疫組織化学的染色で目的の特定のタンパク質マーカーを検出することができます。
このプロトコールを試みる場合、細胞を氷上に1時間以内保持することによって細胞生存率を維持し、塞栓形成およびマウスの死亡率を防ぐために細胞懸濁液中の気泡を避けることが重要である。尾静脈注射後、ルシフェラーゼイメージングで脳転移の成長と進行を監視します。安楽死後、ステレオ蛍光顕微鏡および組織学で転移病変が確認された。
