Моделирование метастазирования в головной мозг с помощью инъекции воспалительных клеток рака молочной железы в хвостовую вену

Мы использовали метод хвостовой вены для создания метастазов в мозг на мышиных моделях с использованием клеточных линий, полученных от пациентов с воспалительным раком молочной железы, или IBC, высокоагрессивной формой первичного рака молочной железы. Генерация метастазов в головном мозге на мышиных моделях обычно включает внутрисердечные или внутрисонные артериальные инъекции. Тем не менее, метод хвостовой вены имеет преимущество перед этими методами, поскольку он лучше имитирует этапы колонизации метастазов в мозг и относительно прост в выполнении.

Доктора Сяодин Ху и Эмили Виллодре, которые являются инструкторами в моей лаборатории, продемонстрируют процедуру. Чтобы обнаружить метастазы в головном мозге с помощью визуализации GFP через 8-10 недель после инъекции опухолевых клеток, продезинфицируйте мышь 70%-ным этанолом и удалите шерсть с головы и ушей. Разрежьте шейную область шеи.

Вырежьте и удалите череп, чтобы можно было извлечь мозг. Поместите мозг в тканевую кассету и поместите кассету в контейнер с холодным DPBS не более чем на один час. Для визуализации с помощью стереомикроскопии перенесите мозг в 100-сантиметровую тканевую чашку под стереомикроскопом, оснащенным ультрафиолетовым светом, и выберите объектив 0,5x, чтобы обеспечить визуализацию всего мозга.

Нажмите кнопку live view и сфокусируйте изображение, пока мозг находится в вентральном положении. Выберите подходящий фильтр в программном обеспечении и микроскопе для флуоресцентного маркера в клетках и сделайте снимок. Не перемещая образец, переключитесь на изображение светлого поля и выберите фильтр светлого поля.

Сфотографируйтесь. Затем визуализируйте мозг в дорсальном положении, как было показано ранее. Чтобы проанализировать все изображения мозга, сначала преобразуйте файлы изображений из TIFF в JPEG, чтобы их можно было открыть на любом компьютере, не имеющем соответствующего программного обеспечения.

Затем откройте пару светлопольных и флуоресцентных изображений и выберите файл и объедините каналы. Выберите нужные компоненты, нажмите кнопку ОК и сохраните объединенное изображение. Чтобы количественно определить область опухоли головного мозга на флуоресцентном изображении, выберите автоматический выбор.

Переместите стрелку в область положения GFP и щелкните, чтобы автоматически создать выборку. Затем нажмите еще раз, чтобы подтвердить выбор. Все измерения будут показаны.

Если можно наблюдать более одной положительной области GFP, повторите измерение с последующей областью. Метастатические поражения головного мозга могут быть обнаружены уже через восемь недель после инъекции с помощью визуализации люциферазы и стереофлуоресцентной микроскопии. После визуализации участки метастазов в головном мозге могут быть зафиксированы формалином и обработаны для окрашивания гематоксилином и эозином для подтверждения наличия метастазов в головном мозге, а также для иммуногистохимического окрашивания для обнаружения специфических белковых маркеров, представляющих интерес.

При использовании этого протокола важно поддерживать жизнеспособность клеток, держа их на льду не более одного часа, и избегать пузырьков воздуха в клеточной суспензии, чтобы предотвратить образование эмболов и смертность мышей. После инъекции в хвостовую вену мы контролируем рост и прогрессирование метастазов в головном мозге с помощью визуализации люциферазы. После эвтаназии стереофлуоресцентная микроскопия и гистология подтвердили метастазирование очагов.