Stentor coeruleus se ha empleado durante mucho tiempo como un organismo modelo para comprender la regeneración unicelular. Si bien se conoce la línea de tiempo para la regeneración morfológica visual, la línea de tiempo para la regeneración funcional sigue siendo desconocida. Este ensayo rastrea la motilidad de la población del centro sometida a regeneración sincronizada de tal manera que se pueda cuantificar la función de recuperación de la pérdida.
Se puede adaptar para su uso con otros tipos de células. La falta de un sello seguro de la cámara de imágenes dará lugar a que los pozos se filtren entre sí o a que se formen burbujas de aire dentro de los pozos. Para los investigadores que no están familiarizados con el uso de espaciadores de silicona, recomendamos encarecidamente que PSW u otro medio limpio se canalice en cada uno de los pozos para probar si hay fugas antes de su uso.
La construcción de las cámaras de muestra es más fácil de mostrar que de describir verbalmente. Como lo es el proceso para extraer patrones de motilidad de los datos de video adquiridos. Para comenzar, corte un trozo de lámina espaciadora de silicona de 250 micrómetros de espesor ligeramente más pequeña tanto en altura como en anchura que un portaobjetos de microscopio.
Use un punzón entero para crear pozos circulares dejando suficiente espacio entre los pozos vecinos para garantizar un buen sellado. Iniciar la regeneración del aparato oral incubando células de stentor coeruleus en 10% sacarosa o 2%uria durante dos minutos. Luego lavar tres veces con medio fresco.
Pipetee suavemente aproximadamente 10 estenadores en cada pozo. Tener cuidado de hacer coincidir el volumen de la muestra con el volumen del pozo lo más cerca posible. Cierre los pozos bajando suavemente un trozo de vidrio de cubierta sobre los pozos a partir de un borde.
Use un objeto estrecho y ligeramente flexible, como una punta de pipeta de 10 microlitros para presionar hacia abajo sobre el vidrio de la cubierta donde entra en contacto con la lámina de silicona para garantizar un buen sellado. Coloque la muestra en el escenario del microscopio y ajuste el microscopio al aumento más bajo disponible para que uno quepa bien en el marco. Comience el lapso de tiempo y adquiera un video de diez segundos a 30 cuadros por segundo de cada pozo en cada punto de tiempo.
Para calibrar, adquiera una imagen clara de una diapositiva de calibración o una regla clara con la misma configuración de ampliación que los vídeos. Usando cualquier programa de visualización de imágenes, cuente el número de píxeles entre marcas de una distancia física conocida. Descargue los dos scripts, rastree las celdas y limpie los rastros a una ubicación fácil de recordar en la computadora y transfiera los videos de datos a esta computadora también.
Organice los videos de datos en carpetas. Uno por cada punto de tiempo. Utilice las celdas de seguimiento de script para realizar un seguimiento de celda automatizado en los vídeos de datos abriendo celdas de pista y ejecutando el script Elija agregar a ruta" si se lo solicita una ventana emergente que normalmente solo ocurrirá cuando el script se ejecute por primera vez desde una carpeta determinada.
Cuando se le solicite, seleccione uno o más videos de datos para iniciar el seguimiento. Navegue hasta los vídeos de datos y, una vez satisfecho con la lista de archivos, haga clic en abrir"Para rechazar manualmente los rastros anómalos o falsos, abra los rastros limpios en la ventana del editor de MATLAB haciendo doble clic en el archivo. En el símbolo del sistema, seleccione la salida de la carpeta de datos por celdas de seguimiento.
Desplácese hasta una de las carpetas creadas y selecciónela. Cuando se le solicite, escriba uno para mantener el seguimiento y cero para rechazar el seguimiento. A continuación, pulse Intro para pasar al siguiente seguimiento.
Comience descargando el guión titulado diagramas de espagueti. Abra y ejecute el script. Cuando aparezca la ventana del explorador de archivos con el mensaje, seleccione la carpeta que desea abrir.
Desplácese hasta la carpeta de uno de los puntos de tiempo. Cuando se solicita la calibración, ¿cuál es el número de píxeles por milímetro? Escriba el valor de calibración y pulse Intro.
Ajuste los ejes de la gráfica según sea necesario cambiando la línea 55 del script, que de forma predeterminada se establece en RR igual a cuatro. para incluir un radio de hasta cuatro milímetros. Guarda la parcela.
Los resultados muestran la motilidad colectiva de la población de células estentoras a las dos, tres, siete y ocho horas del proceso de regeneración del aparato oral. Estas gráficas muestran tanto el aumento esperado en el número de individuos móviles como el aumento de cuatro veces en el rango de las células más móviles dentro de la población. Las células de natación más rápidas, si se inician cerca del borde, están restringidas de nadar completamente en línea recta y su rango de movimiento parece más pequeño.
Las células del tracto se clasificaron en tres categorías distintas, no móviles sin retención visible rápida, no móviles con retención visible y móviles. El resultado mostró un histograma apilado que resume los recuentos de células relativas en estas categorías en función de la nuestra en la regeneración. En épocas posteriores, se encontró un número significativo de células en colonias con ayunos visibles que sugerían fuertemente que habían explorado el medio ambiente y se habían unido preferentemente cerca de otras de su tipo.
Es importante seleccionar las dimensiones del pozo de muestra que funcionan bien para el stentor coeruleus que tienen aproximadamente un milímetro de tamaño. Esto incluye el grosor del espaciador de silicona de 5/16 pulgadas de diámetro y 10 celdas por pozo. Estos números deben ajustarse al adaptar este protocolo para otros tipos de células.
Este ensayo se puede realizar junto con el ARN-I para investigar y comparar la regeneración de diferentes fenotipos de estenadores.
