El objetivo de este procedimiento es medir la actividad enzimática de los miembros individuales de la familia de la proteína arginina metiltransferasa en las células. La actividad se mide determinando sus niveles de metilación de arginina y los niveles totales de proteína biomarcadores mediante la western blotting fluorescente cuantitativa. La ventaja del método descrito es el rendimiento directo en cualquier laboratorio con cultivo celular y capacidades fluorescentes de Western blot.
Las directrices detalladas con respecto a los biomarcadores, anticuerpos y compuestos inhibidores dos se proporcionan en el artículo. Y aquí describimos los pasos cruciales involucrados en el procedimiento experimental. Y el procedimiento se muestra para el formato de 24 pozos.
En primer lugar, preparar tampón de lisis, añadir benzonasa e inhibidor de proteínas cóctel recién antes de su uso. Retire todos los medios de los pozos. Lave con 100 microlitros PBS y agregue 60 microlitros de tampón de lisis al pozo.
Incubar durante un minuto a temperatura ambiente, balanceando las placas para distribuir el tampón de lisis sobre las células. Luego agregue tres microlitros de 20% SDS para encontrar una concentración de 1% y mezcle con agitación suave. Transfiera el lysate en los tubos de Eppendorf y manténgalo en el hielo.
Determine la concentración de proteínas de sus muestras usando el kit de ensayo de proteína BCA, o use cualquier otro método que tolere 1% SDS en solución. Después de ajustar la concentración de proteínas con tampón de lisis para que sea igual a través de las muestras a 20 microlitros de cuatro veces tampón de carga a 60 microlitros de lisiado celular, y calentar a 95 grados durante cinco minutos. La adición de benzonasa al tampón de lisis hidroliza rápidamente los ácidos nucleicos, que reducen la viscosidad del lisiado celular.
Los lisatos con benzonasa no son viscosos. Los lisatos sin benzonasa tienen un gran glob de ADN pegajoso que no se peletizará cuando se hila. Cargue hasta cinco a 20 microgramos de lisato celular total para las proteínas histonas, y de 20 a 100 microgramos para otras proteínas en un gradiente de cuatro a 12 bis-tris en gel de proteínas.
Alrededor de la jalea en fregonas como el amortiguador circundante durante aproximadamente dos horas a 100 voltios, o hasta que el tinte de carga azul llegue a la parte inferior del gel. Si realiza una transferencia húmeda, monte el sándwich de transferencia en un tampón de transferencia de tris-glicina helado. Active la membrana de PVDF remojando en metanol y equilibre el gel en el tampón de transferencia durante 30 segundos antes del montaje.
Coloque las esponjas de papel de filtro, membrana de PVDF y gel de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Transfiera proteínas en tampón de transferencia de tris-glicina a 70 voltios durante una a una hora y media sobre hielo. Después de la transferencia, incubar la membrana durante 30 minutos en el tampón de bloqueo.
Enjuague con tampón de lavado e incube con anticuerpos primarios durante la noche a cuatro grados. Al día siguiente, lave la membrana tres veces durante cinco minutos con tampón de lavado, incube con anticuerpos secundarios marcados con fluorescente durante 30 minutos a temperatura ambiente y lave tres veces durante cinco minutos con tampón de lavado. Coloque la membrana boca abajo en la placa de vidrio del captador de imágenes fluorescentes western blot.
Cubra con la lámina de goma y retire las burbujas de aire. Lea la señal a 700 y 800 nanómetros. Una vez que se realiza el escaneo, vaya a la imagen y ajuste la señal de canal 700 y 800 para ver las bandas claramente.
Aquí la señal de 700 canales mostrada como roja representa los niveles totales de proteína, y la señal de 800 canales mostrada como verde representa los niveles de proteína metilada. A continuación, vaya a análisis y seleccione la lectura mediana superior e inferior. Para medir la intensidad de las bandas, seleccione la herramienta dibujar rectángulo y dibuje la forma alrededor de las bandas que desea cuantificar.
Ve a formas donde encuentras intensidades de 700 y 800 canales. La columna llamada señal proporciona niveles de intensidad con fondo restado. Los resultados se pueden copiar directamente en el archivo de Excel.
Aquí está el ejemplo que muestra el análisis de la actividad de PRMT1 en células sobre la inhibición con el tipo uno ms023 de PRMT. La actividad de PRMT1 se mide determinando los niveles asimétricos de dimetilación de la arginina H4 3. Aquí, los niveles de metilación, bandas verdes bajan de una manera dependiente de la dosis, mientras que los niveles totales de histonas bandas rojas permanecen sin cambios.
Para determinar el compuesto IC50, trazar el logaritmo de la concentración de inhibidores contra los niveles asimétricos de dimetilación de arginina-3 de histonas H4 normalizados a los niveles totales de histonas seguidos de análisis de ajuste no lineal. El método descrito permite una detección doble responsable y reproducible de la actividad de la metiltransferasa de la proteína en células. La ventaja del método es que utiliza una conocida metodología de western blotting que es accesible para laboratorios académicos y se puede modificar fácilmente dependiendo del equipo de laboratorio.
Los detalles del ensayo, incluidas las proteínas biomarcadores, los anticuerpos y los dos compuestos químicos para cada miembro individual de la familia PRMT, se proporcionan en el artículo.
