מטרת הליך זה היא למדוד את הפעילות האנזימטית של חברים בודדים במשפחת החלבון ארגינין מתילטרנספראז בתאים. הפעילות נמדדת על ידי קביעת רמות מתילציה ארגינין שלהם ואת הרמות הכוללות של חלבון ביו סמן באמצעות סופג פלואורסצנטי כמותי המערבי. היתרון של השיטה המתוארת הוא הביצועים הפשוטים בכל מעבדה עם תרבות תאים ויכולות כתם מערביות פלואורסצנטיות.
ההנחיות המפורטות לגבי סמנים ביולוגיים, נוגדנים ומעכבים שתי תרכובות מסופקים במאמר. וכאן תיארנו צעדים מכריעים המעורבים בהליך הניסויי. ואת ההליך מוצג עבור 24 פורמט היטב.
ראשית, הכינו מאגר תמוגה, הוסיפו קוקטייל מעכבי בנזונז וחלבון טרי לפני השימוש. הסר את כל המדיה מבארות. לשטוף עם 100 מיקרוליטר PBS, ולהוסיף 60 microliters של מאגר תמוגה לבאר.
דגירה במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, נדנדה את הצלחות כדי להפיץ את מאגר התמוגה על התאים. לאחר מכן הוסיפו שלושה מיקרוליטרים של 20%SDS כדי למצוא ריכוז של 1% ולערבב על ידי טלטול עדין. מעבירים את הליזאט לצינורות אפנדורף ושומרים אותו על הקרח.
קבעו את ריכוז החלבון של הדגימות שלכם באמצעות ערכת בדיקה של חלבון BCA, או השתמשו בכל שיטה אחרת שסובלת מ-1%SDS בתמיסה. לאחר התאמת ריכוז החלבון עם מאגר תמוגה להיות שווה על פני הדגימות ב 20 microliters של ארבע פעמים טעינת מאגר 60 microliters של ליזאט התא, וחום ב 95 מעלות במשך חמש דקות. התוספת של בנזונאס למאגר תמוגה במהירות הידרוליזה חומצות גרעין, אשר להפחית צמיגות ליזלת התא.
ליסטים עם בנזונז אינם צמיגים. Lysates ללא בנזונס יש גוש גדול של DNA דביק כי לא גלולה כאשר סובב. טען ל-5 עד 20 מיקרוגרם של ליסט התאים הכולל לחלבוני היסטון, ו-20 עד 100 מיקרוגרם לחלבונים אחרים בג'ל חלבון שיפוע של 4 עד 12 ביס-טריס.
סביב הג'לי בסחבות כחוצץ שמסביב במשך כשעתיים ב 100 וולט, או עד צבע העמסה הכחול מגיע לתחתית הג'ל. אם אתה מבצע העברה רטובה, להרכיב את כריך ההעברה במאגר העברת טריס-גליצין קר כקרח. הפעל קרום PVDF על ידי השרייה במתנול וג'ל שיווי משקל במאגר העברה במשך 30 שניות לפני ההרכבה.
מניחים נייר מסנן ספוגים, קרום PVDF וג'ל על פי הוראות היצרן. מעבירים חלבונים במאגר העברת טריס-גליצין ב-70 וולט למשך 1 עד 1.5 שעות על קרח. לאחר ההעברה, דגירה הממברנה במשך 30 דקות בחסימה חוצץ.
יש לשטוף עם חיץ שטיפה, ולהדגיר עם נוגדנים ראשוניים במשך הלילה בארבע מעלות. למחרת, לשטוף קרום שלוש פעמים במשך חמש דקות עם חוצץ לשטוף, דגירה עם נוגדנים משניים שכותרתו פלואורסצנטית במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולשטוף שלוש פעמים במשך חמש דקות עם חוצץ לשטוף. מניחים את הממברנה עם הפנים כלפי מטה על צלחת הזכוכית של הדימוי הכתם המערבי הפלואורסצנטי.
מכסים עם יריעת הגומי ומסירים את כל בועות האוויר. קרא את האות ב-700 ו-800 ננומטר. לאחר סיום הסריקה, עבור אל התמונה והתאם אות ערוץ 700 ו- 800 כדי לראות רצועות בבירור.
כאן אות ערוץ 700 המוצג כאדום מייצג את רמות החלבון הכוללות, ואות ערוץ 800 המוצג כירוק מייצג את רמות החלבון המתילציה. לאחר מכן, עבור אל ניתוח ובחר קריאה חציונית עליונה ותחתונה. למדידת עוצמת הרצועות, בחרו בכלי מלבן ציור וציירו את הצורה סביב הרצועות שברצונכם לכמת.
עבור לצורות שבהן אתה מוצא עוצמות של 700 ו- 800 ערוצים. העמודה הנקראת אות מספקת רמות אינטנסיביות עם רקע מופחת. ניתן להעתיק את התוצאות ישירות לקובץ Excel.
הנה הדוגמה המציגה את הניתוח של פעילות PRMT1 בתאים על עיכוב עם מעכב מסוג PRMT אחד MS023. פעילות PRMT1 נמדדת על ידי קביעת רמות דימתילציה אסימטרית H4 היסטון H4. כאן, רמות המתילציה, הרצועות הירוקות יורדות באופן תלוי מינון, בעוד שרמות ההיסטון הכוללות של הרצועות האדומות נשארות ללא שינוי.
כדי לקבוע תרכובת IC50, להתוות את הלוגריתם של ריכוז מעכבים נגד histone H4 ארגנין-3 רמות דימתילציה אסימטרי מנורמל לרמות histone הכולל ואחריו ניתוח התאמה לא ליניארית. השיטה המתוארת מאפשרת זיהוי כפול אחראי וניתן לשחזור של פעילות החלבון מתיל טרנספראז בתאים. היתרון של השיטה הוא שהיא משתמשת במתודולוגיית סופג מערבית ידועה הנגישה למעבדות אקדמיות וניתן לשנותה בקלות בהתאם לציוד המעבדה.
פרטי ההסתעפות כולל חלבוני סמן ביולוגי, נוגדנים ושתי תרכובות כימיות עבור כל בן משפחה PRMT בודדים מסופקים במאמר.
