Целью данной процедуры является измерение ферментативной активности отдельных членов семейства белков аргининметилтрансферазы в клетках. Активность измеряется путем определения их уровней метилирования аргинина и общих уровней биомаркерного белка с использованием количественного флуоресцентного западного блоттинга. Преимуществом описанного метода является простая производительность в любой лаборатории с клеточной культурой и флуоресцентным вестерн-блотом.
В статье приведены подробные рекомендации относительно биомаркеров, антител и ингибиторов двух соединений. И здесь мы описали важнейшие шаги, связанные с экспериментальной процедурой. А процедура показана для формата 24 скважины.
Сначала подготовьте буфер лизиса, добавьте бензоназу и коктейль ингибитора белка перед употреблением. Удалите все носители из скважин. Промыть 100 микролитрами PBS и добавить в лунку 60 микролитров лизисного буфера.
Инкубировать в течение одной минуты при комнатной температуре, раскачивая пластины, чтобы распределить буфер лизиса по клеткам. Затем добавьте три микролитра 20% SDS, чтобы найти 1% концентрацию, и перемешайте путем мягкого встряхивания. Переложите лисат в трубки Эппендорфа и держите его на льду.
Определите концентрацию белка в ваших образцах с помощью набора для анализа белка BCA или используйте любые другие методы, которые допускают 1% SDS в растворе. После регулировки концентрации белка с помощью лизисного буфера необходимо, чтобы он был равным по образцам при 20 микролитрах четырехкратной загрузки буфера до 60 микролитров клеточного лизата и нагревания при 95 градусах в течение пяти минут. Добавление бензоназы в буфер лизиса быстро гидролизует нуклеиновые кислоты, которые снижают вязкость лизата клеток.
Лизаты с бензоназой не вязкие. Лизаты без бензоназы имеют большой шарик слизи ДНК, который не будет гранулирован при раскрутке. Загрузите от пяти до 20 микрограммов общего клеточного лизата для гистоновых белков и от 20 до 100 микрограммов для других белков в градиенте от четырех до 12 бис-трис белкового геля.
Вокруг желе в швабре в качестве окружающего буфера около двух часов при 100 вольтах или до тех пор, пока синий загрузочный краситель не достигнет дна геля. Если вы выполняете мокрую переноску, соберите бутерброд с переносом в ледяной трис-глициновый буфер переноса. Активируйте мембрану PVDF путем замачивания метанола и уравновешивания геля в буфере переноса в течение 30 секунд перед сборкой.
Поместите губки фильтровальной бумаги, PVDF мембраны и геля в соответствии с инструкциями производителя. Перенос белков в трис-глициновом буфере переноса при 70 вольтах в течение одного-полутора часов на льду. После переноса инкубируют мембрану в течение 30 минут в блокирующем буфере.
Промыть с помощью промывного буфера и инкубировать с первичными антителами на ночь при четырех градусах. На следующий день промыть мембрану три раза в течение пяти минут с помощью промывного буфера, инкубировать с флуоресцентно мечеными вторичными антителами в течение 30 минут при комнатной температуре и трижды промыть в течение пяти минут с буфером для стирки. Поместите мембрану лицевой стороной вниз на стеклянную пластину флуоресцентного западного блот-образзера.
Накройте резиновым листом и удалите пузырьки воздуха. Считывание сигнала на 700 и 800 нанометров. После завершения сканирования перейдите к изображению и отрегулируйте сигнал 700 и 800 каналов, чтобы четко видеть полосы.
Здесь сигнал 700 каналов, показанный красным цветом, представляет общие уровни белка, а сигнал 800 каналов, показанный зеленым цветом, представляет уровни метилированного белка. Затем перейдите к анализу и выберите медианное верхнее и нижнее значение. Чтобы измерить интенсивность полос, выберите инструмент «Нарисовать прямоугольник» и нарисуйте фигуру вокруг полос, которые вы хотите количественно оценить.
Перейдите к фигурам, где вы найдете интенсивности 700 и 800 каналов. Столбец, называемый сигналом, предоставляет уровни интенсивности с вычитаемым фоном. Результаты можно скопировать непосредственно в файл Excel.
Вот пример, показывающий анализ активности PRMT1 в клетках при ингибировании ингибитором PRMT типа one MS023. Активность PRMT1 измеряется путем определения асимметричных уровней асимметричного диметилирования аргинина H4 H4. Здесь уровни метилирования, зеленые полосы снижаются в зависимости от дозы, в то время как общие уровни гистонов красных полос остаются неизменными.
Для определения соединения IC50 построят график логарифма концентрации ингибитора против асимметричных уровней диметилирования аргинина-3 гистона H4, нормализованных до общих уровней гистонов, с последующим нелинейным анализом соответствия. Описанный способ позволяет ответственно и воспроизводимое двойное обнаружение активности белкаметилтрансферазы в клетках. Преимущество метода заключается в том, что он использует хорошо известную методологию вестерн-блоттинга, которая доступна для академических лабораторий и может быть легко изменена в зависимости от лабораторного оборудования.
В статье приведены подробности анализа, включая биомаркерные белки, антитела и два химических соединения для каждого отдельного члена семьи PRMT.
