この手順の目標は、細胞内のプロテインアルギニンメチルトランスレシーゼファミリーの個々のメンバーの酵素活性を測定することです.活性は、定量的蛍光ウェスタンブロッティングを使用して、アルギニンメチル化レベルおよびバイオマーカータンパク質の総レベルを決定することによって測定される。記載された方法の利点は、細胞培養および蛍光ウェスタンブロット機能を有するあらゆる実験室での簡単な性能である。
バイオマーカー、抗体および阻害剤2つの化合物に関する詳細なガイドラインが記事に記載されています。ここでは、実験手順に関わる重要なステップについて説明しました。そして、手順は24ウェル形式で示されています。
まず、リシスバッファーを調製し、使用前にベンゾナーゼおよびタンパク質阻害剤カクテルを新たに添加する。井戸からすべてのメディアを削除します。100マイクロリットルPBSで洗浄し、60マイクロリットルの溶菌バッファーをウェルに加えます。
室温で1分間インキュベートし、プレートを揺らし、細胞の上にリシスバッファーを分配する。その後、20%SDSの3マイクロリットルを加えて1%濃度を見つけ、穏やかな揺れで混ぜます。リセートをエペンドルフチューブに移し、氷の上に置いておく。
BCAタンパク質アッセイキットを使用してサンプルのタンパク質濃度を決定するか、溶液中の1%SDSを許容する他の方法を使用してください。リシスバッファーでタンパク質濃度を調整した後、サンプル全体で4回の負荷バッファーの20マイクロリットルで60マイクロリットルの細胞ライセートに、そして5分間95度で加熱します。リシスバッファーにベンゾナスを添加すると核酸を急速に加水分解し、細胞のリゼート粘度を低下させる。
ベンゾネーゼを使用したリセートは粘性がありません。ベンゾナーゼのないライセートは、紡いだときにペレットを与えないグーイDNAの大きなグロブを有する。ヒストンタンパク質の全細胞ライセートの5〜20マイクログラム、および勾配4〜12ビストリスタンパク質ゲル内の他のタンパク質の20〜100マイクログラムに負荷を与えます。
周囲の緩衝液としてモップのゼリーの周りを100ボルトで約2時間、または青色のローディング染料がゲルの底に達するまで。湿式移送を行う場合は、アイスコールドトリスグリシン転送バッファーにトランスファーサンドイッチを組み立てます。メタノールに浸漬してPVDF膜を活性化し、前のアセンブリーの30秒前に移動バッファーにゲルを平衡化します。
メーカーの指示に従ってスポンジのフィルターペーパー、PVDF膜およびゲルを置きます。トリスグリシン移動バッファー内のタンパク質を 70 ボルトで氷上で 1 ~ 1 時間半転送します。転写後、ブロックバッファーで30分間膜をインキュベートする。
洗浄バッファーでリンスし、一次抗体を一晩4度でインキュベートする。翌日、洗浄バッファーで5分間膜を3回洗浄し、蛍光標識二次抗体を室温で30分間インキュベートし、洗浄バッファーで5分間3回洗浄します。蛍光ウェスタンブロットイメージャーのガラス板に膜を下に置きます。
ゴムシートで覆い、気泡を取り除きます。700および800ナノメートルで信号を読みます。スキャンが完了したら、画像に移動し、バンドをはっきりと見るために700と800チャンネル信号を調整します。
ここで赤色として示される700チャネル信号は、全タンパク質レベルを表し、800チャネル信号は緑色で示し、メチル化タンパク質のレベルを表す。次に、分析に移動し、中央値の上と下の読み取り値を選択します。バンドの強度を測定するには、長方形描画ツールを選択し、数値化するバンドの周囲に図形を描画します。
700 チャンネルと 800 チャンネルの強度を見つける図形に移動します。シグナルと呼ばれる列は、背景を減算した強度レベルを提供します。結果は、Excel ファイルに直接コピーできます。
以下に、PRMT型1阻害物質MS023による細胞阻害時のPRMT1活性の分析を示す例である。PRMT1活性はヒストンH4アルギニン3不斉ジメチル化レベルを決定することによって測定される。ここで、メチル化レベルは、緑色のバンドが用量依存的に下がり、総ヒストンレベルは赤いバンドは変わらない。
化合物IC50を決定するために、ヒストンH4アルギニン-3不斉ジメチル化レベルに対する阻害剤濃度の対数をプロットし、ヒストンレベルを合計して非線形適合分析を行う。記載された方法は、細胞内のタンパク質メチルトランスファーゼの活性の責任と再現性の二重検出を可能にする。この方法の利点は、学術ラボでアクセス可能で、ラボ機器に応じて簡単に変更できる、よく知られたウェスタンブロッティング方法論を利用できることです。
本稿では、各PRMTファミリーメンバーに対するバイオマーカータンパク質、抗体および化学2つの化合物を含むアッセイの詳細が提供されています。
