Ziel dieses Verfahrens ist es, die enzymatische Aktivität einzelner Mitglieder der Protein Arginin Methyltransferase-Familie in Zellen zu messen. Die Aktivität wird gemessen, indem ihre Argininmethylierungswerte und Gesamtgehalte an Biomarkerprotein unter Verwendung von quantitativem fluoreszierendem Western Blotting bestimmt werden. Der Vorteil der beschriebenen Methode ist die einfache Leistung in jedem Labor mit Zellkultur und fluoreszierenden Western Blot-Fähigkeiten.
Die detaillierten Richtlinien zu Biomarkern, Antikörpern und Inhibitoren zwei Verbindungen sind im Artikel enthalten. Und hier haben wir die entscheidenden Schritte des experimentellen Verfahrens beschrieben. Und die Prozedur wird für das 24-Well-Format gezeigt.
Bereiten Sie zuerst den Lysepuffer vor, fügen Sie Benzonase und Proteininhibitorcocktail vor dem Gebrauch frisch hinzu. Entfernen Sie alle Medien aus Vertiefungen. Mit 100 Mikroliter PBS waschen und 60 Mikroliter Lysepuffer in den Brunnen geben.
Eine Minute bei Raumtemperatur inkubieren und die Platten schaukeln, um den Lysepuffer über die Zellen zu verteilen. Fügen Sie dann drei Mikroliter von 20% SDS hinzu, um eine Konzentration von 1% zu finden, und mischen Sie sie durch sanftes Schütteln. Lysat in Eppendorf-Röhren überführen und auf Eis halten.
Bestimmen Sie die Proteinkonzentration Ihrer Proben mit dem BCA-Protein-Assay-Kit oder verwenden Sie andere Methoden, die 1% SDS in Lösung tolerieren. Nach Der Einstellung der Proteinkonzentration mit Lysepuffer ist die Probe bei 20 Mikrolitern viermal Ladenpuffer auf 60 Mikroliter Zelllysat gleich und erhitzen sie fünf Minuten lang bei 95 Grad. Die Zugabe von Benzonase zum Lysepuffer hydrolysiert schnell Nukleinsäuren, die die Zelllysatviskosität reduzieren.
Lysate mit Benzonase sind nicht viskos. Lysate ohne Benzonase haben einen großen Klecks klebrige DNA, die beim Spinnen nicht pelletiert. Laden Sie fünf bis 20 Mikrogramm Gesamtzelllysat für Histonproteine und 20 bis 100 Mikrogramm für andere Proteine in einem Gradienten von vier bis 12 Bistrisproteingelen auf.
Um das Gelee in Wischmopps als umgebenden Puffer für etwa zwei Stunden bei 100 Volt oder bis der blaue Ladefarbstoff den Boden des Gels erreicht. Wenn Sie einen Nasstransfer durchführen, montieren Sie das Transfersandwich in einem eiskalten Tris-Glycin-Transferpuffer. Aktivieren Sie die PVDF-Membran, indem Sie Methanol einweichen und gel vor der Montage 30 Sekunden lang im Transferpuffer ausgleichen.
Legen Sie Schwämme Filterpapier, PVDF-Membran und Gel gemäß den Anweisungen des Herstellers. Transferproteine in Tris-Glycin-Transferpuffer bei 70 Volt für ein bis eineinhalb Stunden auf Eis. Nach dem Transfer die Membran für 30 Minuten im Blockierpuffer inkubieren.
Mit Waschpuffer abspülen und über Nacht bei vier Grad mit primären Antikörpern inkubieren. Am nächsten Tag die Membran dreimal fünf Minuten lang mit waschpuffer waschen, mit fluoreszierend markierten sekundären Antikörpern 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und dreimal fünf Minuten lang mit Waschpuffer waschen. Legen Sie die Membran mit der Vorderseite nach unten auf die Glasplatte des fluoreszierenden Western Blot Imagers.
Mit der Gummifolie abdecken und Luftblasen entfernen. Lesen Sie das Signal bei 700 und 800 Nanometern. Sobald der Scan abgeschlossen ist, gehen Sie zum Bild und passen Sie das 700- und 800-Kanal-Signal an, um die Bänder klar zu sehen.
Hier steht das rot dargestellte 700-Kanal-Signal für den Gesamtproteingehalt und das grün dargestellte 800-Kanal-Signal für den Gehalt an methyliertem Protein. Gehen Sie als Nächstes zur Analyse und wählen Sie den medianen oberen und unteren Wert aus. Um die Intensität der Bänder zu messen, wählen Sie das Rechteckwerkzeug zeichnen und zeichnen Sie die Form um die Bänder, die Sie quantifizieren möchten.
Gehen Sie zu Formen, in denen Sie Dichten von 700 und 800 Kanälen finden. Die Spalte namens Signal liefert Intensitätsstufen mit subtrahiertem Hintergrund. Die Ergebnisse können direkt in die Excel-Datei kopiert werden.
Hier ist das Beispiel, das die Analyse der PRMT1-Aktivität in Zellen bei Hemmung mit PRMT-Typ-Eins-Inhibitor MS023 zeigt. Die PRMT1-Aktivität wird durch Bestimmung der asymmetrischen Dimethylierungswerte von Histon H4 Arginin 3 gemessen. Hier sinken die Methylierungswerte, grüne Bänder dosisabhängig, während die gesamten histonischen roten Bänder unverändert bleiben.
Um die Verbindung IC50 zu bestimmen, zeichnen Sie den Logarithmus der Inhibitorkonzentration gegen Histon H4 Arginin-3 asymmetrische Dimethylierungswerte, normalisiert auf Gesamt histonspiegel, gefolgt von einer nichtlinearen Anpassungsanalyse. Das beschriebene Verfahren ermöglicht einen verschuldbaren und reproduzierbaren Doppelnachweis der Aktivität der Proteinmethyltransferase in Zellen. Der Vorteil der Methode besteht darin, dass sie eine bekannte westliche Blotting-Methodik verwendet, die für akademische Labore zugänglich ist und je nach Laborausstattung leicht modifiziert werden kann.
Die Assay-Details einschließlich Biomarkerproteine, Antikörper und chemische zwei Verbindungen für jedes einzelne PRMT-Familienmitglied sind im Artikel enthalten.
