이 절차의 목표는 세포에 있는 단백질 아르기닌 메틸 전달효소 가족의 개별 적인 일원의 효소 활동을 측정하는 것입니다. 활성은 양적 형광 서부 블로팅을 사용하여 그들의 아르기닌 메틸화 수준 및 바이오 마커 단백질의 총 수준을 결정해서 측정됩니다. 설명된 방법의 장점은 세포 배양 및 형광 서양 블롯 기능을 가진 모든 실험실에서 간단한 성능이다.
바이오 마커에 관한 상세한 지침, 항체 및 억제제 2개의 화합물은 이 기사에서 제공됩니다. 그리고 여기에서 우리는 실험 절차와 관련된 중요한 단계를 설명했습니다. 그리고 절차는 24 잘 형식에 표시됩니다.
먼저, 용해 완충제준비, 벤조나제 와 단백질 억제제 칵테일을 사용하기 전에 신선하게 넣으세요. 우물에서 모든 미디어를 제거합니다. 100 마이크로리터 PBS로 세척하고 60 마이크로리터의 리시 버퍼를 웰에 추가합니다.
실온에서 1분 동안 배양하여 플레이트를 흔들어 셀 위에 용해 버퍼를 분배합니다. 그런 다음 20% SDS의 마이크로리터 3개를 추가하여 1%의 농도를 찾고 부드러운 흔들림으로 섞습니다. 리세이트를 에펜도르프 튜브로 옮기고 얼음 위에 보관하십시오.
BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 시료의 단백질 농도를 결정하거나 용액에서 1% SDS를 용인하는 다른 방법을 사용하십시오. 용해 버퍼로 단백질 농도를 조정한 후 4회 적재 버퍼의 20 마이크로리터에서 60 마이크로리터의 세포 용액으로, 5분 동안 95도에서 가열한다. 용해 완충에 벤조나아제를 첨가하여 세포 용해 점도를 감소시키는 핵산을 빠르게 가수분해합니다.
벤조나아제와 리자테는 점성이 없습니다. 벤조나아제없이 lysates는 스펀 할 때 펠릿하지 않습니다 끈적 끈적한 DNA의 큰 덩어리가있다. 히스톤 단백질을 위해 5~20마이크로그램의 총 세포 용액, 그라데이션 4-12 bis-tris 단백질 젤의 다른 단백질에 대해 20~100 마이크로그램을 적재합니다.
100볼트에서 약 2시간 동안 주변 버퍼로, 또는 파란색 로딩 염료가 젤 의 바닥에 도달할 때까지 젤리 주위는 주변 버퍼로 움직입니다. 젖은 이송을 수행하는 경우, 얼음 차가운 트리스 글리신 전달 버퍼에 전송 샌드위치를 조립합니다. 메탄올에 담그고 30초 전에 전달 버퍼에 젤을 계면하여 PVDF 멤브레인을 활성화합니다.
제조업체의 지침에 따라 스폰지 필터 용지, PVDF 멤브레인 및 젤을 놓습니다. 얼음에 1 시간 반 동안 70 볼트에서 트리글리신 전달 버퍼에서 단백질을 전송합니다. 전송 후 멤브레인을 블로킹 버퍼에서 30분 동안 배양합니다.
세척 버퍼로 헹구고, 4도에서 하룻밤 동안 1 차 적인 항체로 배양하십시오. 다음날, 세척 버퍼로 5 분 동안 세 번 세척 막, 실온에서 30 분 동안 형광으로 표시된 이차 항체로 배양하고 세척 버퍼로 5 분 동안 세 번 씻습니다. 형광 서양 블롯 이미더의 유리 판에 멤브레인을 내려 놓습니다.
고무 시트로 덮고 기포를 제거하십시오. 700 및 800 나노미터에서 신호를 읽으십시오. 스캔이 완료되면 이미지로 이동하여 700 및 800 채널 신호를 조정하여 밴드를 명확하게 확인합니다.
여기서 빨간색으로 표시된 700 채널 신호는 총 단백질 수준을 나타내고, 녹색으로 표시된 800 채널 신호는 메틸화된 단백질의 수준을 나타낸다. 다음으로 분석으로 이동하여 중앙값 상단 및 하단 판독값을 선택합니다. 대역 강도를 측정하려면 직사각형 도구를 그리고 정량화하려는 대역 주위에 모양을 그립니다.
700 채널과 800 채널의 강도를 찾을 수있는 모양으로 이동합니다. 신호라는 컬럼은 배경 이하가 있는 강도 수준을 제공합니다. 결과는 Excel 파일에 직접 복사할 수 있습니다.
다음은 PRMT 타입 1 억제제 MS023을 가진 억제시 세포에서 PRMT1 활성의 분석을 보여주는 예입니다. PRMT1 활성은 히스톤 H4 아르기닌 3 비대칭 디메틸화 수준을 결정하여 측정된다. 여기, 메 틸 화 수준, 녹색 밴드 복용량 종속 방식으로 내려 가서, 총 히스톤 수준 레드 밴드는 변경되지 않은 유지 하는 동안.
화합물 IC50을 결정하기 위해, 히스톤 H4 아르기닌-3 비대칭 디메틸화 레벨에 대한 억제제 농도의 로가릿심을 총 히스톤 수준으로 정규화한 다음 비선형 맞춤 분석을 한다. 설명된 방법은 세포에서 단백질 메틸 전달의 활동의 책임 있고 재현 가능한 이중 검출을 허용합니다. 이 방법의 장점은 학술 실험실에 접근 할 수 있고 실험실 장비에 따라 쉽게 수정 할 수있는 잘 알려진 서양 블로팅 방법론을 활용한다는 것입니다.
각 개별 PRMT 가족 구성원에 대한 바이오 마커 단백질, 항체 및 화학 적 2개의 화합물을 포함하는 분석 세부 사항은 이 문서에서 제공된다.
