Hola, en este video le mostraremos cómo explorar los epitranscriptomas m6A y m5C sobre la infección viral. Para comenzar el experimento, necesitará 50 millones de células para los no infectados y 50 millones para la afección infectada. Para obtener un conjunto de datos de alta calidad tras el análisis, deberá lograr una infección universal.
Aquí infectamos estas células con un vector basado en el VIH y medimos la GFP codificada viralmente por FACS. En este caso, teníamos el 80% de las células infectadas y continuamos con el flujo de trabajo comenzando con la extracción total de ARN. Así que dividimos las células en alícuotas de 10 millones cada una y las lijamos en 1 ml de Trizol.
Luego agregamos 200 microlitros de cloroformo al lisado celular y lo mezclamos por inversión. En este punto, dejamos reposar el lisado durante tres minutos a temperatura ambiente y luego centrifugamos todas las muestras a alta velocidad durante 15 minutos a cuatro grados. Esperará ver una separación de fases en tres fases diferentes, como se muestra aquí.
El ARN se asienta en la fase superior, por lo que transfiera cuidadosamente la fase acuosa a un tubo fresco prestando atención a no transferir la capa orgánica. En este punto, agregue 0.5 ml de isopropanol a la fase acuosa y mezcle cuidadosamente por inversión. Las muestras se pueden incubar una hora a 80 grados para garantizar la precipitación de ARN.
Tras la centrifugación a alta velocidad, debería poder ver un buen pellet de ARN como se muestra aquí. Deseche cuidadosamente el sobrenadante ya sea por inversión o por pipeteo, prestando atención a no interrumpir el pellet. Luego lave el pellet de ARN con un ml de etanol de grado molecular al 75%.
Y vórtice la muestra brevemente. Tras la centrifugación, asegúrese de recuperar una buena bolita de ARN blanco. Deseche el sobrenadante y deje que el gránulo de ARN se seque durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Resuspender cada pellet en 20 microlitros de agua y agrupar todas las muestras de la misma condición juntas. El ARN total ya está listo para el aislamiento de ARNm mediante selección de poli-A. Para cada muestra de 75 microgramos de ARN, prepare 200 microlitros de perlas magnéticas oligo-DT y lávelas en un ml de tampón de unión.
Coloque el tubo en un soporte magnético y permita que las perlas se unan al imán durante una mezcla. Deseche el sobrenadante y repita el procedimiento para un segundo lavado. Luego retire las perlas de los soportes magnéticos y vuelva a suspenderlas cuidadosamente en 100 microlitros de tampón de unión.
En este punto, prepare la muestra de ARN dividiéndolas en 75 microgramos de ARN por alícuota resuspendida en 100 microlitros de agua. Agregue 100 microlitros de tampón de unión e incube durante dos minutos a 65 grados. Luego gire las muestras e incube en hielo.
Agregue 100 microlitros de perlas magnéticas lavadas a cada muestra de ARN y permita la unión en una rueda giratoria durante 15 minutos a temperatura ambiente. Tras la incubación, coloque el tubo de nuevo en un estante magnético y déjelos incubar durante un minuto. Luego recupere el sobrenadante en un tubo fresco y manténgalo a un lado para una segunda ronda de aislamiento.
Lave las cuentas dos veces con 200 microlitros de tampón de lavado y luego proceda a la elución. Para eluir el ARN seleccionado de poli-A de las perlas magnéticas, agregue 20 microlitros de TRIS HCl helado a cada muestra y pipetee cuidadosamente. Luego incuba tus muestras a 80 grados durante dos minutos para liberar el ARN de las perlas.
Transfiera el sobrenadante que contiene ARN seleccionado de poli-A a un tubo fresco, teniendo cuidado de evitar el arrastre de perlas. El paso de elución, así como el paso de aislamiento, deben repetirse dos veces para aumentar el rendimiento de ARNm. El ARNm ahora está listo para ingresar a la tubería meRIP-Seq en el paso de fragmentación o ir directamente a la conversión de bisulfito.
El primer paso para entrar en la canalización meRIP-Seq consiste en la fragmentación del ARNm. Para ello, se necesitan cinco microgramos de ARNm divididos en alícuotas de 18 microlitros en tubos de 0,2 mL. Para garantizar datos consistentes, es fundamental trabajar rápidamente y con solo unas pocas muestras en ese momento.
Para este experimento se ha optimizado la fragmentación con el fin de obtener fragmentos de un tamaño entre 115 y 200 nucleótidos. Luego agregue dos microlitros de reactivo de fragmentación a cada tubo que contenga 18 microlitros de ARNm teniendo cuidado al depositar la gota en la pared del tubo. Girar todas las muestras para permitir el contacto entre el reactivo y el ARN al mismo tiempo e incubar a 70 grados durante 15 minutos.
Una vez finalizada la incubación, detener la reacción añadiendo dos microlitros de 0,5 M de EDTA. En este punto, puede purificar su ARNm fragmentado con el método de su elección y proceder a un control de calidad de ARN mediante analizador de fragmentos. Este paso es opcional, pero permitirá evaluar el tamaño del fragmento antes de activar la precipitación de ARN.
Como se puede ver aquí en el cuarto carril, obtenemos para ambos nuestro fragmento de muestra de alrededor de 150 nucleótidos cada uno. Luego procedimos con meRIP-Seq. El primer paso consiste en un par de perlas magnéticas A/G con anticuerpos anti-m6A o controles IgG.
Para cada plan de reacción, transfiera 25 microlitros de perlas magnéticas a un tubo fresco. Tenga en cuenta que necesitará al menos una condición específica de m6A y una condición de control. Lave cada 25 microlitros de perlas con 250 microlitros de tampón IP.
Resusponga suavemente las perlas canalizando hacia arriba y hacia abajo y coloque el tubo en la rejilla magnética durante un minuto para permitir la separación de las perlas. Retire y deseche el sobrenadante, prestando atención a no aspirar las perlas magnéticas y repita el paso de lavado una vez. Luego vuelva a suspender las perlas magnéticas en 100 microlitros de búfer IP por cada 25 microlitros de volumen original de cuentas.
Prepare y etiquete un tubo por cada condición. En nuestro caso, tendremos dos tubos para la condición infectada, uno para m6A y otro para el control de IgG, y dos tubos para la condición no infectada. Luego agregue 100 microlitros de cuentas lavadas en cada tubo.
Las perlas ahora están listas para combinarse con anticuerpos específicos o controles de IgG. Agregue cinco microgramos de anticuerpo anti-m6A específico o anticuerpo de control anti-IgG a cada tubo que contenga 100 microlitros de perlas magnéticas lavadas. Permita la conjugación anticuerpo-perlas incubando el tubo 30 minutos en una rueda giratoria.
Mientras tanto, proceda con la preparación de la muestra. Para cada condición planificada, ya sea específica de m6A o control de IgG, su material de partida será de 2.5 microgramos de ARNm fragmentado resuspendido 100 microlitros de agua. Para tener un volumen de reacción final de 500 microlitros, agregue 295 microlitros de agua a cada muestra.
Agregue luego cinco microlitros de inhibidor de la ARNasa concentrado a 40 unidades por microlitro para una cantidad total de 200 unidades por muestra y mezcle suavemente. Finalmente agregue 100 microlitros de búfer IP concentrado 5X a cada tubo. Las muestras ya están listas para la reacción de precipitación inmune.
Recupere las perlas magnéticas junto con el anticuerpo de la rueda giratoria y gírelas hacia abajo. Agregue luego 500 microlitros de las muestras previamente preparadas a cada 100 microlitros de cuentas junto con los anticuerpos específicos. Mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces para resuspendir completamente las cuentas.
Incubelos o su reacción meRIP en una rueda giratoria a cuatro grados durante dos horas. Una vez que termine la incubación, gire hacia abajo cada tubo y colóquelos en una rejilla magnética durante un minuto para permitir la separación de cuentas. Luego retire la fracción no unida y colóquela en un tubo nuevo y guárdela para un análisis más detallado, si es necesario.
Retire el imán del bastidor y vuelva a suspender todas las muestras en 500 microlitros de búfer IP. Resuspender cada muestra cuidadosamente mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Inserte el imán en la rejilla, incube durante un minuto y luego retire cuidadosamente el sobrenadante.
Repita el lavado dos veces y luego proceda con la elución. Para cada par de muestras, m6A específicas y de control, prepare 225 microlitros de tampón de elución que contengan 20 milimolares de m6A purificados. A continuación, añadir 100 microlitros de tampón de elución por muestra.
Incubar toda la muestra una hora a cuatro grados en un balancín. Luego recoja toda la muestra de ARN enriquecido con m6A en un tubo fresco y proceda con una segunda ronda de elución. Purifique el ARN enriquecido con m6A con el método de su elección Y luego, en este punto, las muestras están listas para la preparación y secuenciación de la biblioteca.
Para investigar la modificación de m5C, utilizamos la conversión de bisulfito. Comience el experimento con 500 nanogramos de ARN poliadenilado. Aunque es opcional, agregar a su muestra 500 picogramos de ARN agotado de poli-A para garantizar la representación ribosómica y 0.5 microlitros de secuencia sintética disponible comercialmente le permitirá evaluar la tasa de conversión de bisulfito en la secuenciación.
Ajuste su muestra a un volumen final de 20 microlitros en agua y luego agregue 130 microlitros de reactivo de conversión de ARN a cada muestra. Mezcle cuidadosamente canalizando hacia arriba y hacia abajo y gire hacia abajo toda la muestra para asegurarse de que no queden gotas en el costado de los tubos. Incubar toda la muestra en una máquina de PCR durante tres ciclos de desnaturalización a 70 grados durante cinco minutos y conversión de bisulfito a 54 grados durante 45 minutos.
Realice la desaminación en columna agregando directamente sobre una columna vacía, 250 microlitros de tampón de unión de ARN, 150 microlitros de su muestra convertida en bisulfito. Mezcle la muestra canalizando hacia arriba y hacia abajo, pero prestando atención a no tocar los filtros de columna. Agregue 400 microlitros de etanol 95-100% a la mezcla tampón de unión de ARN de muestra directamente en la columna.
Cierre la tapa y mezcle inmediatamente por inversión. Gire hacia abajo su muestra durante 30 segundos y descarte el flujo. Lave su columna con tampón de lavado y luego agregue 200 microlitros de solución de desulfonación al centro de cada columna.
Incuba toda tu muestra durante 30 minutos a temperatura ambiente. Gire la muestra durante 30 segundos y luego proceda con dos rondas de lavado. Agregue 400 microlitros de tampón de lavado a cada muestra, centrífique durante 30 segundos a toda velocidad y deseche el flujo.
Coloque la columna en un nuevo tubo vacío y eluya el ARN convertido en bisulfito en 20 microlitros de agua. Controle la eficiencia de conversión de bisulfito mediante RT-qPCR y luego proceda a la preparación y secuenciación de la biblioteca. Tras el análisis bioinformático, aquí hay algunos ejemplos de resultados que puede obtener con este flujo de trabajo.
Aquí comparamos el epitranscriptoma de las células infectadas por el VIH frente a las células no infectadas. a las 24 horas después de la infección. En el panel A, puede ver los resultados que obtenemos explorando el epitranscriptome m6A.
En este gráfico, trazamos las lecturas enriquecidas m6A sobre el análisis meRIP-Seq. Podemos ver muy bien que un dedo de zinc está hipermetilado 24 horas después de la infección. Realizamos el mismo tipo de análisis para la investigación del epitranscriptoma m5C en el panel B.In este gráfico, cada citosina no metilada se muestra en rojo, mientras que la proporción de citosina que ha sido metilada m5C se muestra en azul.
Como puede ver, PHLPP1, las tres citosinas que están hipermetiladas 24 horas después de la infección por VIH. En general, este flujo de trabajo permite investigar tanto el epitranscriptoma M6A como el m5C de las células infectadas y también se puede aplicar como tal en partículas virales. La comprensión de la infección viral es capaz de modificar el paisaje epitranscriptómico del huésped que nos dará acceso a una nueva capa de regulación.
La investigación de transcripciones metiladas diferenciales sobre la infección viral proporcionará, por supuesto, un recurso valioso para una nueva intervención terapéutica. En el enlace aquí abajo puede encontrar nuestro recurso de acceso abierto para la investigación de la transcripción metilada diferencial sobre la infección por VIH a lo largo del tiempo.
