Este protocolo ayuda a comprender el reclutamiento espacial y temporal de proteínas de reparación del daño del ADN, teniendo en cuenta la fase del ciclo celular. Para la discriminación del ciclo celular, utilizamos PCNA marcado con proteínas fluorescentes como un marcador de la fase S, que elude los artefactos introducidos por otros métodos de sincronización del ciclo celular. Esto, combinado con la microirradiación basada en láser, proporciona una resolución espaciotemporal sin precedentes a la cinética de proteínas de reparación del daño en el ADN.
El éxito en la utilización rutinaria de nuestro protocolo se basa en el conocimiento básico de las imágenes confocales. 24 horas antes de la microirradiatura, plate un total de ocho por 10 a la cuarta célula en 500 microlitros a un mililitro de medios en un vidrio de cubierta de cuatro pomos. Una hora antes de la microirradiatura, intercambie el medio de crecimiento regular con un medio de imagen que contenga olaparib o un control de vehículo como DMSO.
Al menos cuatro horas antes de la obtención de imágenes, encienda la cámara ambiental y los componentes del microscopio. Encienda la calefacción, el suministro de dióxido de carbono y el regulador de humedad. Inicialice las fuentes de luz junto con las líneas láser al menos una hora antes de transferir las células al microscopio.
Engrase el objetivo del microscopio y coloque un vidrio de cubierta con cámara debajo del microscopio. Para seleccionar células de fase S en una población asíncrona, busque a través del ocular el patrón de localización único del PCNA marcado con mPlum en fase S y seleccione un campo de visión que tenga suficientes células de fase S para la microirradiación. Establezca la región de interés para la microirradiatura utilizando el software asociado para insertar líneas binarias.
Para establecer el número deseado de líneas y el espaciado, haga clic en binario, luego seleccione insertar línea, círculo y elipse para dibujar el número deseado de líneas, luego convierta estas líneas binarias en ROI de estimulación haciendo clic en ROI, mueva binario a ROI, luego haga clic con el botón derecho en cualquiera de los ROI y seleccione usar como ROI de estimulación S1. Coloque estas líneas en el campo de visión para que pasen a través del núcleo de las células. Antes de la microirradiación, para identificar los focos de PCNA para su posterior análisis, tome una imagen de mayor resolución del campo de visión estableciendo los parámetros necesarios en la GUI compacta A1 LFOV y las ventanas del área de escaneo A1 LFOV seguidas de presionar el botón de captura. Para configurar la microirradiación, abra la pestaña de estimulación ND, luego acceda a la ventana de programación de tiempo para adquirir una serie de imágenes de preestimulación y luego una serie de imágenes de postestimulación utilizando los escáneres Galvano.
Configure tres fases en la ventana de programación de tiempo. En la columna adquisición y estimulación, seleccione adquisición, estimulación y adquisición para las tres fases, respectivamente. Para la fase de estimulación, establezca S1 como el ROI.
En la ventana Galvano XY, configure la salida de potencia del 100% láser para la línea láser de 405 nanómetros y establezca el tiempo de permanencia para la microirradiación. Para configurar la creación de imágenes de lapso de tiempo para la ventana de tiempo y los intervalos deseados, utilice la GUI compacta A1 LFOV de programación de tiempo y las ventanas de área de escaneo A1 LFOV. Optimice la configuración de porcentaje de potencia, ganancia y desplazamiento del láser para reducir el blanqueamiento fotográfico durante la obtención de imágenes en la ventana de gui compacta A1 LFOV.
Dependiendo de la cinética de la proteína, extienda o acorte el intervalo entre imágenes o la duración del lapso de tiempo total estableciendo el intervalo y la duración deseados para la fila de adquisición de la tercera fase en la ventana de programación de tiempo. Presione ejecutar ahora para ejecutar la microirradiatura y la posterior imagen de lapso de tiempo. Al final de la imagen de lapso de tiempo, guarde los ROI de estimulación como imágenes separadas, lo que será útil para identificar las coordenadas de la microirradia en cualquier software posterior utilizado para el análisis.
El PCNA tiene una distribución completamente homogénea en el núcleo en las fases G1 y G2. En la fase S, el PCNA se localiza en sitios de replicación del ADN, que se pueden visualizar como puntos brillantes en el núcleo. En las células de fase S temprana, las manchas son relativamente pequeñas y están distribuidas equitativamente por todo el núcleo de la célula.
Mientras progresan a la fase S media, las manchas se vuelven borrosas y se localizan más hacia el perímetro del núcleo y los nucleolos. En la fase S tardía, las manchas se reducen en número, pero se vuelven cada vez más grandes a medida que el PCNA se concentra en los sitios de replicación tardía. Las dosis bajas de energía, como 1.000 microsegundos de tiempo de permanencia, no inducen el reclutamiento de EGFP-FBXL10, un respondedor de rotura de doble cadena, pero son suficientes para inducir el reclutamiento de NTHL1-mCherry, una proteína de la vía de reparación de la escisión base que se recluta en sitios de daño oxidativo del ADN.
A los 3.000 microsegundos de tiempo de permanencia, se reclutan tanto EGFP-FBXL10 como NTHL1-mCherry, demostrando una salida láser que genera tanto lesiones oxidativas como roturas de doble cadena. EXO1b alcanza un nivel máximo de acumulación y sitios de microirradiación alrededor de un minuto, y luego comienza lentamente a desconectarse de las lesiones de ADN. En presencia de olaparib, la acumulación de EXO1b en la banda láser en un minuto es significativamente menor en comparación con el control del vehículo.
Es crucial que el microscopio tenga tiempo suficiente para calentarse y que el cultivo y las condiciones sean óptimas para cada experimento para garantizar resultados consistentes. Además, es importante optimizar la configuración del láser con diferentes reporteros de daño del ADN para detectar lesiones específicas en el ADN. Después de la microirradiación, considere validar los resultados con métodos bioquímicos clásicos, como el fraccionamiento, la inmunoprecipitación o ChIP.
Estos enfoques muestrean una población celular más grande, proporcionando así fuerza estadística.
