Этот протокол помогает понять пространственную и временную рекрутмент белков репарации повреждений ДНК с учетом фазы клеточного цикла. Для дискриминации клеточного цикла мы используем флуоресцентный белок, помеченный PCNA, в качестве маркера S-фазы, который обходит артефакты, введенные другими методами синхронизации клеточного цикла. Это в сочетании с лазерным микролучением дает беспрецедентное пространственно-временное разрешение кинетики белка репарации повреждений ДНК.
Успешное рутинное использование нашего протокола основывается на базовых знаниях о конфокальной визуализации. За 24 часа до микрооблучения накладывают в общей сложности восемь на 10 до четвертой ячейки в 500 микролитров на один миллилитр среды на четырехствольно камерном покровном стекле. За час до микролучения обменяйте обычную питательную среду на визуализирующую среду, содержащую либо олапариб, либо элемент управления транспортным средством, такой как DMSO.
По крайней мере, за четыре часа до визуализации включите камеру окружающей среды и компоненты микроскопа. Включите отопление, подачу углекислого газа и регулятор влажности. Инициализируйте источники света вместе с лазерными линиями по крайней мере за час до переноса клеток в микроскоп.
Смазывайте маслом объектив микроскопа и поместите под микроскоп камерное покровное стекло. Чтобы выбрать клетки S-фазы в асинхронной популяции, посмотрите через глаз на уникальный паттерн локализации mPlum, помеченный PCNA в S-фазе, и выберите поле зрения, в которое достаточно S-фазовых клеток для микроизлучения. Задайте интересуемую область для микроизлучения с помощью соответствующего программного обеспечения для вставки двоичных линий.
Чтобы задать нужное количество строк и интервалов, щелкните двоичный код, затем выберите вставить линию, круг и эллипс для рисования нужного количества линий, затем преобразуйте эти двоичные линии в стимулирующие ROI, щелкнув ROI, переместите двоичный код в ROI, затем щелкните правой кнопкой мыши любой из ROI и выберите использовать в качестве стимуляции ROI S1. Поместите эти линии в поле зрения так, чтобы они проходили через ядро клеток. Перед микроизлучением, чтобы идентифицировать фокусы PCNA для последующего анализа, сделайте изображение поля зрения с более высоким разрешением, установив необходимые параметры в компактном графическом интерфейсе A1 LFOV и окнах зоны сканирования A1 LFOV с последующим нажатием кнопки захвата. Чтобы настроить микроизлучение, откройте вкладку стимуляции ND, затем получите доступ к окну расписания времени, чтобы получить серию изображений до стимуляции, а затем серию изображений после стимуляции с помощью сканеров Galvano.
Настройте три этапа в окне расписания. В столбце приобретение и стимуляция выберите приобретение, стимуляцию и приобретение для трех фаз соответственно. Для фазы стимуляции установите S1 в качестве ROI.
В окне Galvano XY установите 100% выходную мощность лазера для 405-нанометровой лазерной линии и установите время выдержки для микроизлучения. Чтобы настроить таймлапс-образ для требуемого временного окна и интервалов, используйте компактный графический интерфейс расписания A1 LFOV и окна области сканирования A1 LFOV. Оптимизируйте процент мощности лазера, коэффициент усиления и смещения, чтобы уменьшить отбеливание фотографий во время визуализации в компактном графическом интерфейсе A1 LFOV.
В зависимости от кинетики белка, удлините или сократите интервал между изображениями или продолжительность общего таймлапса, установив желаемый интервал и продолжительность для строки захвата третьей фазы в окне расписания времени. Нажмите кнопку run (Выполнить), чтобы выполнить микроизлучение и последующую временную визуализацию. В конце таймлапс-визуализации сохраните ROI стимуляции в виде отдельных изображений, которые будут полезны для определения координат микроизлучения в любом последующем программном обеспечении, используемом для анализа.
PCNA имеет полностью однородное распределение в ядре в фазах G1 и G2. В S-фазе PCNA локализуется в местах репликации ДНК, которые можно визуализировать как яркие пятна в ядре. В клетках ранней S-фазы пятна относительно невелики и равномерно распределены по всему ядру клетки.
При прогрессировании в середину S-фазы пятна становятся размытыми и локализуются больше по периметру ядра и ядрышка. В поздней S-фазе количество пятен уменьшается, но становится все более крупным, поскольку PCNA концентрируется в поздних местах репликации. Низкие дозы энергии, такие как 1000 микросекунд времени выдержки, не индуцируют рекрутирование EGFP-FBXL10, двухцепочечного ответчика на разрыв, но достаточны для того, чтобы индуцировать рекрутирование NTHL1-mCherry, белка пути восстановления базовой эксцизии, который набирается в места окислительного повреждения ДНК.
При 3 000 микросекундах времени ожидания набираются как EGFP-FBXL10, так и NTHL1-mCherry, демонстрируя лазерный выход, который генерирует как окислительный очаг, так и двухцепочечные разрывы. EXO1b достигает максимального уровня накопления и микрооблучения участков около одной минуты, а затем медленно начинает отстраиваться от поражений ДНК. В присутствии олапариба накопление EXO1b на лазерной полосе в одну минуту значительно меньше по сравнению с управлением транспортным средством.
Крайне важно, чтобы микроскопу было предоставлено достаточно времени для нагрева и чтобы культура и условия были оптимальными для каждого эксперимента, чтобы обеспечить последовательные результаты. Кроме того, важно оптимизировать настройки лазера с различными репортерами повреждений ДНК для проверки конкретных поражений ДНК. После микролучедиирования рассмотрите возможность проверки результатов с помощью классических биохимических методов, таких как фракционирование, иммунопреципитация или ChIP.
Эти подходы отбирают большую популяцию клеток, обеспечивая тем самым статистическую силу.
