يساعد هذا البروتوكول على فهم التوظيف المكاني والزمني لبروتينات إصلاح تلف الحمض النووي ، مع الأخذ في الاعتبار مرحلة دورة الخلية. بالنسبة للتمييز في دورة الخلية ، نستخدم PCNA الموسوم بالبروتين الفلوري كعلامة على مرحلة S ، والتي تتحايل على القطع الأثرية التي أدخلتها طرق مزامنة دورة الخلية الأخرى. هذا جنبا إلى جنب مع الليزر القائم على الإشعاع الدقيق يعطي دقة لا مثيل لها spatiotemporal إلى الحمض النووي إصلاح حركية البروتين الإصلاح.
النجاح في الاستخدام الروتيني لبروتوكولنا يبني على المعرفة الأساسية للتصوير confocal. قبل 24 ساعة من الإشعاع الدقيق، لوحة ما مجموعه ثمانية في 10 إلى الخلايا الرابعة في 500 ميكرولتر إلى ملليلتر واحد من وسائل الإعلام على زجاج غطاء أربع غرف جيدا. قبل ساعة واحدة من الإشعاع الدقيق ، تبادل متوسط النمو العادي مع وسيط التصوير الذي يحتوي إما على olaparib أو التحكم في السيارة مثل DMSO.
قبل التصوير بأربع ساعات على الأقل، قم بتشغيل الغرفة البيئية ومكونات المجهر. قم بتشغيل التدفئة وإمدادات ثاني أكسيد الكربون ومنظم الرطوبة. تهيئة مصادر الضوء جنبا إلى جنب مع خطوط الليزر ساعة واحدة على الأقل قبل نقل الخلايا إلى المجهر.
النفط الهدف المجهر ووضع الزجاج غطاء غرف تحت المجهر. لتحديد خلايا المرحلة S في مجموعة سكانية غير متزامنة، ابحث من خلال العين عن نمط التعريب الفريد ل PCNA الموسومة mPlum في مرحلة S وحدد حقل رؤية يحتوي على خلايا مرحلة S كافية للتشعيع الدقيق. تعيين المنطقة ذات الأهمية للإشعاع الجزئي باستخدام البرنامج المقترن لإدراج خطوط ثنائية.
لتعيين العدد المطلوب من الأسطر والتباعد، انقر فوق ثنائي، ثم حدد إدراج خط ودائرة والقطع الناقص لرسم العدد المطلوب من الخطوط، ثم تحويل هذه الخطوط الثنائية إلى ROIs التحفيز عن طريق النقر على ROI، نقل ثنائي إلى ROI، ثم انقر بزر الماوس الأيمن على أي من ROIs وحدد استخدام التحفيز ROI S1. ضع هذه الأسطر في مجال الرؤية بحيث تمر عبر نواة الخلايا. قبل التشعيع الجزئي، لتحديد بؤر PCNA للتحليل لاحقا، التقط صورة ذات دقة أعلى لحقل الرؤية من خلال تعيين المعلمات الضرورية في واجهة المستخدم الرسومية المدمجة A1 LFOV ونوافذ منطقة المسح الضوئي A1 LFOV متبوعة بذلك الضغط على زر الالتقاط. لإعداد الإشعاع الدقيق ، افتح علامة التبويب تحفيز ND ، ثم قم بالوصول إلى نافذة الجدول الزمني للحصول على سلسلة من صور التحفيز المسبق ثم سلسلة من صور ما بعد التحفيز باستخدام ماسحات Galvano.
إعداد ثلاث مراحل في إطار الجدول الزمني. في عمود الاستحواذ والتحفيز، اختر الاستحواذ والتحفيز والاستحواذ للمراحل الثلاث على التوالي. لمرحلة التحفيز، تعيين S1 كما ROI.
في نافذة Galvano XY، قم بتعيين مخرج طاقة ليزر بنسبة 100٪ لخط ليزر 405 نانومتر وحدد وقت الإسهاب للتشعيع الدقيق. لإعداد تصوير الفاصل الزمني للنافذة الزمنية والفواصل الزمنية المطلوبة، استخدم الجدول الزمني A1 LFOV المضغوط GUI وإطارات منطقة المسح الضوئي A1 LFOV. تحسين نسبة طاقة الليزر، والكسب، وإعدادات الإزاحة لتقليل تبييض الصور أثناء التصوير في إطار واجهة المستخدم الرسومية المدمجة A1 LFOV.
اعتمادا على الحركية من البروتين، تمديد أو تقصير الفاصل الزمني بين الصور أو مدة الفاصل الزمني الإجمالي عن طريق تحديد الفاصل الزمني المطلوب والمدة المطلوبة للصف اقتناء المرحلة الثالثة في إطار الجدول الزمني. اضغط تشغيل الآن لتنفيذ التشعيع الجزئي والتصوير الفاصل الزمني اللاحقة. في نهاية التصوير الفاصل الزمني، حفظ ROIs التحفيز كصور منفصلة، والتي سوف تكون مفيدة لتحديد إحداثيات الإشعاع الدقيق في أي برنامج المصب المستخدمة للتحليل.
PCNA لديه توزيع متجانسة تماما في النواة في G1 و G2 مراحل. في مرحلة S، PCNA مترجمة إلى مواقع النسخ المتماثل الحمض النووي، والتي يمكن تصورها على أنها نقاط مضيئة في النواة. في خلايا المرحلة S المبكرة ، تكون البقع صغيرة نسبيا وتوزع بالتساوي في جميع أنحاء نواة الخلية.
في حين تتقدم إلى منتصف مرحلة S، تصبح البقع غير واضحة وترجمة أكثر نحو محيط النواة والنوكليولي. في مرحلة S المتأخرة ، تنخفض البقع في الأرقام ، ولكنها تصبح كبيرة بشكل متزايد مع تركيز PCNA في مواقع النسخ المتماثل المتأخرة. جرعات منخفضة من الطاقة، مثل 1،000 ميكروثانية من وقت الإقامة، لا تحفز تجنيد EGFP-FBXL10، وهو المستجيب كسر تقطعت بهم السبل مزدوجة، ولكنها كافية للحث على تجنيد NTHL1-mCherry، وهو بروتين مسار إصلاح الختان الأساسية التي يتم تجنيدها لمواقع تلف الحمض النووي التأكسدي.
في 3, 000 ميكروثانية يسكن الوقت, يتم تجنيد كل من EGFP-FBXL10 وNTHL1-mCherry, مما يدل على إخراج الليزر الذي يولد كل من الآفات التأكسدية وفواصل مزدوجة تقطعت بهم السبل. تصل EXO1b إلى الحد الأقصى من مواقع التراكم والإشعاع الدقيق حوالي دقيقة واحدة ، ثم تبدأ ببطء في فك الارتباط من آفات الحمض النووي. في وجود olaparib ، تراكم EXO1b في شريط الليزر في دقيقة واحدة هو أقل بكثير بالمقارنة مع التحكم في السيارة.
ومن الأهمية بمكان أن يتم إعطاء المجهر متسعا من الوقت لتسخين وأن الثقافة والظروف هي المثلى لكل تجربة لضمان نتائج متسقة. بالإضافة إلى ذلك، من المهم تحسين إعدادات الليزر الخاصة بك مع مختلف المراسلين تلف الحمض النووي لاختبار آفات الحمض النووي محددة. بعد التشعيع الدقيق، فكر في التحقق من صحة النتائج باستخدام الطرق الكيميائية الحيوية الكلاسيكية، مثل الكسر أو التحلل المناعي أو ChIP.
هذه النهج عينة عدد أكبر من الخلايا، وبالتالي توفير القوة الإحصائية.
