Les méthodes actuelles d’analyse des cils sont laborieuses et sujettes aux erreurs et aux biais. Notre approche vise à rationaliser le temps et les efforts tout en atténuant les erreurs potentielles. Le principal avantage qu’offre cette technique est une rigueur et une reproductibilité accrues et une analyse quantitative des images.
Ce type d’approche n’est pas seulement pertinent pour l’analyse des cils, mais peut être largement appliqué à de nombreuses questions biologiques cellulaires, y compris celles traitant d’autres organites et protéines cytosquelettiques. Pour commencer, ouvrez le jeu de données d’apprentissage, sélectionnez fichier dans le menu, cliquez sur Importer l’exportation et sélectionnez Créer un fichier ND à partir de la séquence de fichiers. Sélectionnez le dossier contenant l’ensemble de données d’entraînement et la liste des fichiers s’ouvrira au centre de la fenêtre de dialogue.
Définissez manuellement l’organisation des fichiers à l’aide d’au moins une option dans le menu déroulant. Entrez les valeurs numériques correspondantes sous chaque option sélectionnée et sélectionnez aucune lorsque les options ne sont pas sélectionnées. Cliquez sur Convertir pour ouvrir le document ND.
Pour calibrer l’image, faites un clic droit sur l’option non calibrée dans le coin inférieur gauche de l’image. Cliquez sur calibrer le document, puis sur Taille des pixels, entrez la valeur et cliquez sur OK. Sélectionnez les contrôles d’analyse de vue, ouvrez la barre d’outils binaire et sélectionnez détecter automatiquement ou dessiner un objet à la main pour identifier les cils en traçant avec précision les structures ciliaires individuelles sur tous les cadres ouverts.
Pour former l’IA, sélectionnez nis. ai, cliquez sur segment de train. ai pour ouvrir le segment de train.
ai, puis sélectionnez le canal source à utiliser pour la formation. Sélectionnez les binaires GroundTruth appropriés pour entraîner l’IA. Sélectionnez le nombre requis d’itérations pour entraîner l’IA en fonction de la taille et de la distribution binaires, puis sélectionnez le dossier de destination pour enregistrer le fichier AI formé et cliquez sur train pour entraîner le logiciel. Ce processus prend plusieurs heures.
Ouvrez les images confocales expérimentales des cils comme décrit précédemment en convertissant l’échantillon. TIF aux fichiers ND2. Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez multipoint dans le premier menu déroulant et entrez une valeur correspondant au nombre total d’images.
Dans la deuxième liste déroulante, sélectionnez la longueur d’onde et remplacez la valeur par le nombre total de canaux dans le dossier. Le logiciel déverrouillera automatiquement une fenêtre de sélection de longueur d’onde, située en bas, à l’extrémité droite de la fenêtre contextuelle. Dans la fenêtre de sélection de la longueur d’onde, utilisez le menu déroulant couleur pour sélectionner la couleur de chaque couche.
Indiquez à chaque canal un nom différent sous la colonne Nom. Une fois toutes les informations mises à jour, cliquez sur Convertir. Calibrez les images comme décrit précédemment.
Assurez-vous que la taille en pixels du jeu de données expérimental est cohérente avec celle du jeu de données d’apprentissage. Identifiez les cils sur le premier canal en utilisant l’IA entraînée de l’étape précédente. Ouvrez nis.
ai dans le menu, sélectionnez segment. ai, puis sélectionnez AC3 dans les canaux sources. Identifiez ensuite les cils sur le deuxième canal en sélectionnant MCHR1 dans les canaux sources.
Le logiciel dessinera des binaires sur les cils étiquetés. Ensuite, vérifiez les images pour tout binaire mal identifié. Sélectionnez Supprimer l’objet dans la barre d’outils binaire pour supprimer manuellement les fichiers binaires mal identifiés.
Une fois que les cils ont été identifiés et segmentés, analysez différents paramètres de cils, tels que les longueurs et les intensités, à l’aide de l’outil d’analyse générale trois. Sélectionnez l’image dans le menu et cliquez sur nouvelle recette GA3. Une nouvelle fenêtre avec un espace vide au centre sera ouverte.
GA3 détectera automatiquement les binaires correctement étiquetés en fonction de l’IA et inclura le nœud correspondant. GA3 détectera également automatiquement les canaux dans les images et affichera leurs onglets sous les canaux. L’IA segmentera tous les cils comme des objets dans le cadre et détectera les cils incomplets le long des bords du cadre.
Pour les supprimer, sélectionnez traitement binaire, supprimez des objets, puis faites glisser le nœud bordures tactiles dans l’espace vide et connectez le nœud aux fichiers binaires appropriés. Pour mesurer la longueur des cils, sélectionnez la taille de l’objet de mesure, puis la longueur. Faites glisser et déposez le paramètre au centre et connectez-vous au nœud binaire approprié.
Pour mesurer l’intensité des cils, sélectionnez une certaine intensité d’objet. Faites glisser et déposez le paramètre au centre et connectez-vous au nœud binaire et au canal d’intérêt appropriés. Dans le menu de mesure, accédez à ratiométrie d’objet et sélectionnez le coefficient de Mander pour configurer la voie de colocalisation dans GA3 en mesurant le chevauchement de deux canaux dans des cils individuels.
Faites glisser et déposez le nœud de coefficient de Mander dans l’espace vide et connectez-le au binaire et aux canaux appropriés. ApEn les mesures et la table unique en ouvrant le menu de gestion des données. Dans la catégorie de base, sélectionnez la colonne ApEn, puis cliquez sur Exécuter maintenant pour mesurer les cils.
Toutes les mesures apparaîtront dans un seul tableau de sortie. Les images représentatives montrent que l’IA entraînée a correctement identifié les cils in vitro dans les images de cellules IMCD, de cultures hypothalamiques primaires et de cultures hippocampiques, mais pas d’autres structures non ciliaires telles que les ponts cytocinétiques. La longueur des cils variait de 0,5 à 4,5 micromètres dans les cellules IMCD et de deux à 12 micromètres dans la culture hypothalamique et hippocampique.
L’IA a mesuré les longueurs des cils marqués AC3 in vivo dans les images de notre noyau arqué, de notre noyau paraventriculaire et de notre région cornu ammonis. Selon l’analyse, les cils hypothalamiques in vivo variaient de un à 15 micromètres, comme on le voit dans les barres blanches et brunes. Alors que les cils et la région de cornu ammonis variaient de un à 10 micromètres, comme on le voit dans les barres grises.
Fait intéressant, l’intensité du MCHR1 ciliaire était plus forte dans le noyau paraventriculaire que dans le noyau arqué. Les intensités de MCHR1 par rapport à AC3 ont été tracées pour mesurer leur chevauchement. La majorité des cils étaient positifs pour les deux marqueurs, tandis que certains cils étaient positifs pour AC3 ou MCHR1.
Pour quantifier la colocalisation de MTHR1 dans AC3, le coefficient de chevauchement de Mander a été mesuré et il y a eu une augmentation significative du chevauchement dans le noyau paraventriculaire que dans le noyau arqué. Pour mesurer l’intensité le long des cils, la polarité des cils a été définie en utilisant Centrin2-GFP comme marqueur basal du corps. Cela a permis de distinguer la base des cils des pointes des cils positifs de cerise ARL13B-M.
Des changements dans l’intensité de l’ARL13B le long de la longueur des cils ont été observés lorsque l’intensité de l’ARL13B était plus élevée à la base qu’à l’extrémité du ciliium dans le noyau arqué, vu à gauche, ainsi que le PVN, vu à droite. Lors de l’analyse des données avec cette approche, il est important de s’assurer que la qualité et la résolution de l’ensemble de données expérimentales sont cohérentes avec celles utilisées pour former l’IA. L’utilité principale de cette approche est qu’après avoir détecté les cils par l’IA, l’utilisateur peut être créatif sur les propriétés analysées en personnalisant le flux de travail d’analyse intégré dans le logiciel.
