Aktuelle Methoden der Zilienanalyse sind arbeitsintensiv und anfällig für Fehler und Verzerrungen. Unser Ansatz zielt darauf ab, Zeit und Aufwand zu rationalisieren und gleichzeitig potenzielle Fehler zu minimieren. Der Hauptvorteil, den diese Technik bietet, ist eine erhöhte Strenge und Reproduzierbarkeit und quantitative Bildanalyse.
Diese Art von Ansatz ist nicht nur für die Zilienanalyse relevant, sondern kann auch auf viele zellbiologische Fragen angewendet werden, einschließlich derjenigen, die sich mit anderen Organellen und Zytoskelettproteinen befassen. Öffnen Sie zunächst das Trainings-Dataset, wählen Sie Datei aus dem Menü aus, klicken Sie auf Export importieren und wählen Sie ND-Datei aus Dateisequenz erstellen. Wählen Sie den Ordner aus, der den Trainingsdatensatz enthält, und die Liste der Dateien wird in der Mitte des Dialogfensters geöffnet.
Definieren Sie die Organisation von Dateien manuell mit mindestens einer Option im Dropdown-Menü. Geben Sie die entsprechenden numerischen Werte unter jeder ausgewählten Option ein und wählen Sie keine aus, wenn optionen nicht ausgewählt sind. Klicken Sie auf Konvertieren, um das ND-Dokument zu öffnen.
Um das Bild zu kalibrieren, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die option unkalibriert in der unteren linken Ecke des Bildes. Klicken Sie auf Dokument kalibrieren, klicken Sie dann auf Pixelgröße, geben Sie den Wert ein und klicken Sie auf OK. Wählen Sie die Steuerelemente für die Ansichtsanalyse aus, öffnen Sie die binäre Symbolleiste und wählen Sie automatische Erkennung oder Objekt zeichnen, um Zilien von Hand zu identifizieren, indem Sie einzelne Ziliarstrukturen auf allen geöffneten Rahmen präzise nachzeichnen.
Um die KI zu trainieren, wählen Sie nis. ai, klicken Sie auf Zugsegment. ai, um das Zugsegment zu öffnen.
ai box und wählen Sie dann den Quellkanal aus, der für das Training verwendet werden soll. Wählen Sie die entsprechenden GroundTruth-Binärdateien aus, um die KI zu trainieren. Wählen Sie die erforderliche Anzahl von Iterationen aus, um die KI in Abhängigkeit von der binären Größe und Verteilung zu trainieren, wählen Sie dann den Zielordner aus, um die trainierte KI-Datei zu speichern, und klicken Sie auf Trainieren, um die Software zu trainieren. Dieser Vorgang dauert mehrere Stunden.
Öffnen Sie die experimentellen konfokalen Bilder von Zilien wie zuvor beschrieben, indem Sie die Probe konvertieren. TIF-Dateien in ND2-Dateien. Wählen Sie im Popup-Fenster Multipoint aus dem ersten Dropdown-Menü aus und geben Sie einen Wert ein, der der Gesamtzahl der Bilder entspricht.
Wählen Sie im zweiten Dropdown-Feld Wellenlänge aus und ändern Sie den Wert in die Gesamtzahl der Kanäle im Ordner. Die Software entsperrt automatisch ein Wellenlängenauswahlfenster, das sich unten am rechten Ende des Popup-Fensters befindet. Verwenden Sie im Wellenlängenauswahlfenster das Dropdown-Menü Farbe, um die Farbe jedes Kanals auszuwählen.
Geben Sie jedem Kanal unter der Spalte Name einen anderen Namen an. Sobald alle Informationen aktualisiert wurden, klicken Sie auf Konvertieren. Kalibrieren Sie die Bilder wie zuvor beschrieben.
Stellen Sie sicher, dass die Pixelgröße des experimentellen Datasets mit der des Trainingsdatasets übereinstimmt. Identifizieren Sie Zilien auf dem ersten Kanal, indem Sie die trainierte KI aus dem vorherigen Schritt verwenden. Öffne nis.
ai aus dem Menü, wählen Sie Segment. ai, und wählen Sie dann AC3 in den Quellkanälen aus. Identifizieren Sie dann die Zilien auf dem zweiten Kanal, indem Sie MCHR1 in den Quellkanälen auswählen.
Die Software zeichnet Binärdateien auf den beschrifteten Zilien. Überprüfen Sie als Nächstes die Bilder auf falsch identifizierte Binärdateien. Wählen Sie objekt löschen in der binären Symbolleiste aus, um die falsch identifizierten Binärdateien manuell zu löschen.
Sobald die Zilien identifiziert und segmentiert wurden, analysieren Sie verschiedene Zilienparameter wie Längen und Intensitäten mit dem allgemeinen Analyse-Drei-Tool. Wählen Sie das Bild aus dem Menü aus und klicken Sie auf Neues GA3-Rezept. Ein neues Fenster mit einem Leerzeichen in der Mitte wird geöffnet.
GA3 erkennt automatisch die Binärdateien, die entsprechend der KI entsprechend gekennzeichnet sind, und schließt den entsprechenden Knoten ein. GA3 erkennt auch automatisch die Kanäle in den Bildern und zeigt ihre Registerkarten unter den Kanälen an. Die KI segmentiert alle Zilien wie Objekte im Rahmen und erkennt unvollständige Zilien entlang der Ränder des Rahmens.
Alle Messungen werden in einer einzigen Ausgabetabelle angezeigt. Die repräsentativen Bilder zeigen, dass die trainierte KI Zilien in vitro in den Bildern von IMCD-Zellen, primären Hypothalamuskulturen und Hippocampuskulturen richtig identifiziert hat, aber keine anderen nicht-ziliarischen Strukturen wie zytokinetische Brücken. Die Länge der Zilien reichte von 0,5 bis 4,5 Mikrometern in IMCD-Zellen und zwei bis 12 Mikrometern in der Hypothalamus- und Hippocampuskultur.
Die KI maß die Längen von AC3-markierten Zilien in vivo in den Bildern unseres bogenförmigen Kerns, paraventrikulären Kerns und Cornu Ammonis einer Region. Laut der Analyse reichten hypothalamische Zilien in vivo von einem bis 15 Mikrometern, wie in weißen und braunen Balken zu sehen. Während Zilien und die Cornu Ammonis-Region zwischen einem und 10 Mikrometern lagen, wie in grauen Balken zu sehen ist.
Interessanterweise war die Intensität des Ziliar-MCHR1 im paraventrikulären Kern stärker als die im Bogenkern. Die Intensitäten von MCHR1 gegenüber AC3 wurden aufgetragen, um ihre Überlappung zu messen. Die Mehrheit der Zilien war für beide Marker positiv, während einige Zilien entweder für AC3 oder MCHR1 positiv waren.
Um die Kolokalisation von MTHR1 innerhalb von AC3 zu quantifizieren, wurde manders Überlappungskoeffizient gemessen und es gab eine signifikante Zunahme der Überlappung im paraventrikulären Kern als im bogenförmigen Kern. Um die Intensität entlang der Länge der Zilien zu messen, wurde die Polarität der Zilien mit Centrin2-GFP als Basalmarker definiert. Dies ermöglichte es, die Basis der Zilien von den Spitzen der ARL13B-M Kirschpositivilien zu unterscheiden.
Änderungen der ARL13B-Intensität entlang der Länge der Zilien wurden beobachtet, wobei die ARL13B-Intensität an der Basis höher war als an der Spitze des Ciliums im Bogenkern, links zu sehen, sowie PVN, wie rechts zu sehen. Bei der Analyse von Daten mit diesem Ansatz ist es wichtig sicherzustellen, dass die Qualität und Auflösung des experimentellen Datensatzes mit derjenigen übereinstimmt, die zum Trainieren der KI verwendet wird. Der Hauptnutzen dieses Ansatzes besteht darin, dass der Benutzer nach der Erkennung von Zilien durch KI kreativ sein kann, welche Eigenschaften analysiert werden, indem er den in die Software integrierten Analyse-Workflow anpasst.
