השיטות הנוכחיות של ניתוח ריסים הן עבודה אינטנסיבית נוטה שגיאה והטיה. הגישה שלנו מבקשת לייעל את הזמן והמאמץ תוך צמצום שגיאות פוטנציאליות. היתרון העיקרי שטכניקה זו מציעה הוא הקפדה מוגברת ושחזור וניתוח תמונה כמותי.
סוג זה של גישה רלוונטי לא רק ניתוח cilia, אבל יכול להיות מיושם באופן נרחב על שאלות ביולוגיות תאים רבים, כולל אלה העוסקים אברונים אחרים וחלבונים שלד. כדי להתחיל, פתח את ערכת הנתונים של האימון, בחר קובץ מהתפריט, לחץ על ייבוא ייצוא ובחר צור קובץ ND מרצף קבצים. בחר את התיקיה המכילה את ערכת נתוני האימון ורשימת הקבצים תיפתח במרכז חלון הדו-שיח.
הגדר באופן ידני את ארגון הקבצים באמצעות אפשרות אחת לפחות בתפריט הנפתח. הזן את הערכים המספריים המתאימים תחת כל אפשרות שנבחרה ובחר אף אחד בכל מקום שבו לא נבחרו אפשרויות. לחץ על המר כדי לפתוח את מסמך ND.
לכייל את התמונה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על האפשרות הלא מכוילת בפינה השמאלית התחתונה של התמונה. לחץ על כייל מסמך ולאחר מכן לחץ על גודל פיקסל, הזן את הערך ולחץ על אישור. בחר פקדי ניתוח תצוגה, פתח את סרגל הכלים הבינארי ובחר זיהוי אוטומטי או צייר אובייקט לזיהוי יד על-ידי מעקב מדויק אחר מבני ססילי בודדים בכל המסגרות הפתוחות.
להכשרת בנתב"ג בחרו ב-NIS. ai, לחץ על קטע רכבת. ai כדי לפתוח את קטע הרכבת.
תיבת ai ולאחר מכן בחר את ערוץ המקור שישמש לאימון. בחר את הקבצים הבינאריים המתאימים של GroundTruth כדי לאמן את הבינה הה מלאכותית. בחר את המספר הנדרש של איטרציות כדי לאמן את הבינה הבינה מלאכותית בהתאם לגודל הבינארי ולהפצה, ולאחר מכן בחר את תיקיית היעד כדי לשמור את קובץ הבינה המיומן ולחץ על התאמן כדי לאמן את התוכנה. תהליך זה אורך מספר שעות.
פתח את תמונות הקונפוקליות הניסיוניות של ריסים כפי שתואר קודם לכן על ידי המרת המדגם. קבצי TIF לקבצי ND2. בחלון המוקפץ, בחר ריבוי נקודות מהתפריט הנפתח הראשון והזן ערך המתאים למספר הכולל של התמונות.
בתיבה הנפתחת השניה, בחר אורך גל ושנה את הערך למספר הכולל של הערוצים בתיקיה. התוכנה תבטל באופן אוטומטי חלון בחירה באורך גל, הממוקם בקצה התחתון, הימני של החלון המוקפץ. בחלון הבחירה אורך הגל, השתמש בתפריט הנפתח צבע כדי לבחור את הצבע של כל ערוץ.
ספק לכל ערוץ שם אחר תחת עמודת השם. לאחר עדכון כל המידע, לחץ על המר. כייל את התמונות כמתואר קודם לכן.
ודא שגודל הפיקסל של ערכת הנתונים הניסיונית עולה בקנה אחד עם גודל ערכת הנתונים של האימון. זהה ריסים בערוץ הראשון באמצעות בינה מלאכותית מאומנת מהשלב הקודם. פתיחה של שקלים.
ai מהתפריט, בחר פלח שוק. ai, ולאחר מכן בחר AC3 בערוצי המקור. לאחר מכן זהה את הריסים בערוץ השני על-ידי בחירת MCHR1 בערוצי המקור.
התוכנה תצייר הקבצים הבינאריים על הריסים המסומנים. לאחר מכן בדוק את התמונות עבור כל הקבצים הבינאריים שלא זוהו. בחר מחק אובייקט בסרגל הכלים הבינארי כדי למחוק באופן ידני את הקבצים הבינאריים שהותרו באופן שגוי.
לאחר שהריסים זוהו ופולחו, נתחו פרמטרים שונים של ריסים, כגון אורכים ועוצמות, באמצעות הכלי הכללי Three. בחרו תמונה מהתפריט ולחצו על מתכון GA3 חדש. ייפתח חלון חדש עם שטח ריק במרכז.
GA3 יזהה באופן אוטומטי את הקבצים הבינאריים המסומנים כראוי בהתאם ל- AI ויכלול את הצומת המתאים. GA3 גם יזהה באופן אוטומטי את הערוצים בתמונות ויציג את הכרטיסיות שלהם תחת ערוצים. ה- AI יפלח את כל הריסים כמו אובייקטים במסגרת ותזהה ריסים לא שלמים לאורך קצות המסגרת.
כדי להסיר אותם, בחר עיבוד בינארי, הסר אובייקטים ולאחר מכן גרור את צומת הגבולות הנוגעים ללב אל השטח הריק וחבר את הצומת לקבצים הבינאריים המתאימים. למדידת אורך הריסים, בחרו גודל עצם מדידה ולאחר מכן אורך. גרור ושחרר את הפרמטר למרכז והתחבר לצומת הבינארי המתאים.
כדי למדוד עוצמות ריסים, בחר עוצמת אובייקט מסוימת. גרור ושחרר את הפרמטר למרכז והתחבר לצומת הבינארי המתאים ולערוץ העניין המתאים. בתפריט המדידה, עבור ליחס אובייקט ובחר מקדם של מנדר כדי להגדיר את מסלול הלוקוקליזציה ב- GA3 על-ידי מדידת החפיפה של שני ערוצים בתוך ריסים בודדים.
גרור ושחרר את צומת המקדם של המנדר בשטח הריק וחבר אותו לקובץ הבינארי והתעלים המתאימים. הנקה את המדידות ואת הטבלה הבודדת על-ידי פתיחת תפריט ניהול הנתונים. בקטגוריה הבסיסית, בחר עמודת ApEn ולאחר מכן לחץ על הפעל כעת כדי למדוד ריסים.
כל המדידות יופיעו בטבלת פלט אחת. התמונות המייצגות מראות כי בינה מלאכותית מאומנת זוהתה כראוי בסיליה במבחנה בתמונות של תאי IMCD, תרביות היפותלאמיות ראשוניות ותרבויות היפוקמפוס, אך אין מבנים אחרים שאינם סיביריים כגון גשרים ציטוקינטיים. אורך הריסים נע בין 0.5 ל-4.5 מיקרומטרים בתאי IMCD ושניים עד 12 מיקרומטרים בתרבות ההיפותלמוס וההיפוקמפוס.
בינה מלאכותית מדדה את האורכים של AC3 שכותרתו cilia ב- vivo בתמונות של גרעין הארקואט שלנו, גרעין paraventricular ו cornu ammonis אזור אחד. על פי הניתוח, ריסים ההיפותלמיים ב vivo נע בין אחד ל 15 מיקרומטר, כפי שניתן לראות ברים לבנים וחומים. בעוד ריסים ואזור קורנו אמוניס נע בין אחד ל 10 מיקרומטר, כפי שניתן לראות בסורגים אפורים.
מעניין, עוצמתו של MCHR1 ciliary היה חזק יותר בגרעין paraventricular מזה בגרעין arcuate. האינטנסיביות של MCHR1 נגד AC3 זווו למדוד את החפיפה שלהם. רוב הריסים היו חיוביים עבור שני הסמנים בעוד כמה cilia היו חיוביים עבור AC3 או MCHR1.
כדי לכמת colocalization של MTHR1 בתוך AC3, מקדם החפיפה של מנדר נמדד והייתה עלייה משמעותית בחפיפה בגרעין paraventricular מאשר בגרעין arcuate. כדי למדוד את העוצמה לאורך הריסים, הקוטביות של ריסים הוגדרה באמצעות Centrin2-GFP כסמן הגוף הבזלי. זה מותר להבחין בין הבסיס של ריסים מן הטיפים של ARL13B-M דובדבן חיובי cilia.
שינויים בעוצמת ARL13B לאורך הריסים נצפו כאשר עוצמת ARL13B הייתה גבוהה יותר בבסיס מאשר בקצהסיליום בגרעין ארקואט, הנראה משמאל, כמו גם PVN, כפי שניתן לראות בצד ימין. בעת ניתוח נתונים באמצעות גישה זו, חשוב לוודא כי האיכות והרזולוציה של ערכת הנתונים הניסיונית עולה בקנה אחד עם זה המשמש לאימון בנתב"ג. התועלת העיקרית של גישה זו היא לאחר זיהוי cilia על ידי AI, המשתמש יכול להיות יצירתי על אילו מאפיינים מנותחים על ידי התאמה אישית של זרימת העבודה ניתוח משולב בתוך התוכנה.
