Gli attuali metodi di analisi delle ciglia sono laboriosi e inclini a errori e pregiudizi. Il nostro approccio cerca di semplificare il tempo e gli sforzi, mitigando al contempo potenziali errori. Il vantaggio principale che questa tecnica offre è l'aumento del rigore e della riproducibilità e l'analisi quantitativa delle immagini.
Questo tipo di approccio non è solo rilevante per l'analisi delle ciglia, ma può essere ampiamente applicato a molte questioni biologiche cellulari, comprese quelle che riguardano altri organelli e proteine citoscheletriche. Per iniziare, aprire il set di dati di training, selezionare file dal menu, fare clic su importa esportazione e selezionare Crea file ND dalla sequenza di file. Selezionare la cartella contenente il set di dati di training e l'elenco dei file verrà aperto al centro della finestra di dialogo.
Definire manualmente l'organizzazione dei file utilizzando almeno un'opzione nel menu a discesa. Immettere i valori numerici corrispondenti sotto ciascuna opzione selezionata e selezionarne nessuno laddove le opzioni non sono selezionate. Fare clic su Converti per aprire il documento ND.
Per calibrare l'immagine, fare clic con il pulsante destro del mouse sull'opzione non calibrata nell'angolo in basso a sinistra dell'immagine. Fai clic su Calibra documento, quindi fai clic su Dimensioni pixel, inserisci il valore e fai clic su OK. Selezionare i controlli di analisi della vista, aprire la barra degli strumenti binaria e selezionare rileva automaticamente o disegna l'oggetto a mano per identificare le ciglia tracciando con precisione le singole strutture ciliari su tutti i fotogrammi aperti.
Per addestrare l'IA, selezionare nis. ai, fai clic su segmento treno. ai per aprire il segmento del treno.
ai e quindi selezionare il canale sorgente da utilizzare per l'allenamento. Selezionare i file binari GroundTruth appropriati per addestrare l'IA. Seleziona il numero richiesto di iterazioni per addestrare l'IA in base alle dimensioni e alla distribuzione del binario, quindi seleziona la cartella di destinazione per salvare il file AI addestrato e fai clic su Train per addestrare il software. Questo processo richiede diverse ore.
Aprire le immagini confocali sperimentali delle ciglia come descritto in precedenza convertendo il campione. TIF in file ND2. Nella finestra pop-up, seleziona multi-punto dal primo menu a discesa e inserisci un valore corrispondente al numero totale delle immagini.
Nella seconda casella a discesa, selezionare la lunghezza d'onda e modificare il valore sul numero totale dei canali nella cartella. Il software sbloccherà automaticamente una finestra di selezione della lunghezza d'onda, situata in basso, all'estremità destra della finestra pop-up. Nella finestra di selezione della lunghezza d'onda, utilizzare il menu a discesa del colore per selezionare il colore di ciascun canale.
Fornisci a ciascun canale un nome diverso sotto la colonna del nome. Una volta aggiornate tutte le informazioni, fai clic su Converti. Calibrare le immagini come descritto in precedenza.
Assicurarsi che la dimensione in pixel del set di dati sperimentale sia coerente con quella del set di dati di training. Identifica le ciglia sul primo canale utilizzando l'IA addestrata del passaggio precedente. Aperto nis.
ai dal menu, seleziona segmento. ai, quindi selezionare AC3 nei canali sorgente. Quindi identificare le ciglia sul secondo canale selezionando MCHR1 nei canali sorgente.
Il software disegnerà binari sulle ciglia etichettate. Quindi controllare le immagini per eventuali file binari identificati erroneamente. Selezionare Elimina oggetto nella barra degli strumenti binari per eliminare manualmente i file binari identificati in modo errato.
Una volta che le ciglia sono state identificate e segmentate, analizzare diversi parametri di ciglia, come lunghezze e intensità, utilizzando lo strumento di analisi generale tre. Seleziona l'immagine dal menu e fai clic su nuova ricetta GA3. Verrà aperta una nuova finestra con uno spazio vuoto al centro.
GA3 rileverà automaticamente i file binari opportunamente etichettati in base all'IA e includerà il nodo corrispondente. GA3 rileverà automaticamente anche i canali nelle immagini e visualizzerà le loro schede sotto i canali. L'IA segmenterà tutte le ciglia come oggetti nel telaio e rileverà le ciglia incomplete lungo i bordi del telaio.
Per rimuoverli, selezionare Elaborazione binaria, Rimuovi oggetti, quindi trascinare il nodo Dei bordi di tocco nello spazio vuoto e connettere il nodo ai file binari appropriati. Per misurare la lunghezza delle ciglia, selezionare dimensione dell'oggetto di misurazione e quindi lunghezza. Trascinare e rilasciare il parametro al centro e connettersi al nodo binario appropriato.
Per misurare l'intensità delle ciglia, selezionare l'intensità di un oggetto. Trascina e rilascia il parametro al centro e connettiti al nodo binario e al canale di interesse appropriati. Nel menu di misurazione, vai alla ratiometria degli oggetti e seleziona il coefficiente di Mander per impostare il percorso di colocalizzazione in GA3 misurando la sovrapposizione di due canali all'interno delle singole ciglia.
Trascina e rilascia il nodo coefficiente di Mander nello spazio vuoto e collegalo al binario e ai canali appropriati. ApEn le misure e la singola tabella aprendo il menu di gestione dei dati. Nella categoria di base, selezionare la colonna ApEn e quindi fare clic su Esegui ora per misurare le ciglia.
Tutte le misurazioni appariranno in un'unica tabella di output. Le immagini rappresentative mostrano che l'IA addestrata ha identificato correttamente le ciglia in vitro nelle immagini di cellule IMCD, colture ipotalamiche primarie e colture ippocampali, ma nessun'altra struttura non ciliare come i ponti citocinetici. La lunghezza delle ciglia variava da 0,5 a 4,5 micrometri nelle cellule IMCD e da due a 12 micrometri nella coltura ipotalamo e ippocampale.
L'IA ha misurato le lunghezze delle ciglia marcate AC3 in vivo nelle immagini delle nostre regioni del nucleo arcuato, del nucleo paraventricolare e del cornu ammonis. Secondo l'analisi, le ciglia ipotalamiche in vivo variavano da uno a 15 micrometri, come si vede nelle barre bianche e marroni. Mentre le ciglia e la regione del cornu ammonis variavano da uno a 10 micrometri, come si vede nelle barre grigie.
È interessante notare che l'intensità dell'MCHR1 ciliare era più forte nel nucleo paraventricolare rispetto a quella nel nucleo arcuato. Le intensità di MCHR1 contro AC3 sono state tracciate per misurare la loro sovrapposizione. La maggior parte delle ciglia erano positive per entrambi i marcatori, mentre alcune ciglia erano positive per AC3 o MCHR1.
Per quantificare la colocalizzazione di MTHR1 all'interno di AC3, è stato misurato il coefficiente di sovrapposizione di Mander e c'è stato un aumento significativo della sovrapposizione nel nucleo paraventricolare rispetto al nucleo arcuato. Per misurare l'intensità lungo la lunghezza delle ciglia, la polarità delle ciglia è stata definita utilizzando Centrin2-GFP come marcatore del corpo basale. Ciò ha permesso di distinguere la base delle ciglia dalle punte delle ciglia positive alla ciliegia ARL13B-M.
Cambiamenti nell'intensità di ARL13B lungo la lunghezza delle ciglia sono stati osservati dove l'intensità di ARL13B era più alta alla base che sulla punta del cilio nel nucleo arcuato, visto a sinistra, così come PVN, come visto a destra. Quando si analizzano i dati con questo approccio, è importante assicurarsi che la qualità e la risoluzione del set di dati sperimentali siano coerenti con quelle utilizzate per addestrare l'IA. L'utilità principale di questo approccio è dopo aver rilevato le ciglia da parte dell'IA, l'utente può essere creativo su quali proprietà vengono analizzate personalizzando il flusso di lavoro di analisi integrato all'interno del software.
