Os métodos atuais de análise de cílios são intensivos em mão-de-obra e propensos a erros e viés. Nossa abordagem busca agilizar o tempo e o esforço, ao mesmo tempo em que mitiga possíveis erros. A principal vantagem que essa técnica oferece é o aumento do rigor e da reprodutibilidade e da análise quantitativa de imagens.
Esse tipo de abordagem não é apenas relevante para a análise de cílios, mas pode ser amplamente aplicada a muitas questões biológicas celulares, incluindo aquelas que lidam com outras organelas e proteínas citoesqueléticos. Para começar, abra o conjunto de dados de treinamento, selecione arquivo no menu, clique em exportar importação e selecione criar arquivo ND a partir da sequência de arquivos. Selecione a pasta que contém o conjunto de dados de treinamento e a lista de arquivos será aberta no centro da janela de diálogo.
Defina manualmente a organização de arquivos usando pelo menos uma opção no menu suspenso. Digite os valores numéricos correspondentes em cada opção selecionada e selecione nenhuma onde as opções não forem selecionadas. Clique em converter para abrir o documento ND.
Para calibrar a imagem, clique à direita na opção não calibrada no canto inferior esquerdo da imagem. Clique em calibrar documento, em seguida, clique no tamanho do pixel, digite o valor e clique em ok. Selecione controles de análise de exibição, abra a barra de ferramentas binária e selecione detectar automaticamente ou desenhar objeto para identificar manualmente cilia, rastreando precisamente estruturas ciliar individuais em todos os quadros abertos.
Para treinar a IA, selecione nis. ai, clique no segmento de trem. ai para abrir o segmento de trem.
ai box e, em seguida, selecione o canal de origem a ser usado para treinamento. Selecione os binários GroundTruth apropriados para treinar a IA. Selecione o número necessário de iterações para treinar a IA dependendo do tamanho e distribuição binários e selecione a pasta de destino para salvar o arquivo de IA treinado e clique em treinar o software. Esse processo leva várias horas.
Abra as imagens confocal experimentais de cílios como descrito anteriormente, convertendo a amostra. Arquivos TIF para arquivos ND2. Na janela pop-up, selecione vários pontos do primeiro menu suspenso e digite um valor correspondente ao número total das imagens.
Na segunda caixa suspensa, selecione o comprimento de onda e altere o valor para o número total dos canais da pasta. O software desbloqueará automaticamente uma janela de seleção de comprimento de onda, localizada na parte inferior, na extremidade direita da janela pop-up. Na janela de seleção do comprimento de onda, use o menu suspenso de cores para selecionar a cor de cada canal.
Forneça a cada canal um nome diferente na coluna nome. Uma vez que todas as informações sejam atualizadas, clique em converter. Calibrar as imagens como descrito anteriormente.
Certifique-se de que o tamanho do pixel do conjunto de dados experimental seja consistente com o do conjunto de dados de treinamento. Identifique cilia no primeiro canal usando a IA treinada da etapa anterior. Abra nis.
ai do menu, selecione segmento. ai, em seguida, selecione AC3 nos canais de origem. Em seguida, identifique o cílio no segundo canal selecionando o MCHR1 nos canais de origem.
O software desenhará binários na cília rotulada. Em seguida, verifique as imagens para quaisquer binários mal identificados. Selecione excluir objeto na barra de ferramentas binária para excluir manualmente os binários mal identificados.
Uma vez identificados e segmentados os cílios, analise diferentes parâmetros de ília, como comprimentos e intensidades, utilizando a análise geral três ferramentas. Selecione a imagem no menu e clique na nova receita do GA3. Uma nova janela com um espaço em branco no centro será aberta.
O GA3 detectará automaticamente os binários devidamente rotulados de acordo com a IA e incluirá o nó correspondente. O GA3 também detectará automaticamente os canais nas imagens e exibirá suas guias em canais. A IA segmentará todos os cílios como objetos no quadro e detectará cílios incompletos ao longo das bordas do quadro.
Para removê-los, selecione o processamento binário, remova objetos e arraste o nó de bordas de toque para o espaço em branco e conecte o nó aos binários apropriados. Para medir o comprimento da cília, selecione o tamanho do objeto de medição e, em seguida, o comprimento. Arraste e solte o parâmetro para o centro e conecte-se ao nó binário apropriado.
Para medir as intensidades de cílios, selecione alguma intensidade de objeto. Arraste e solte o parâmetro para o centro e conecte-se ao nó binário apropriado e ao canal de interesse. No menu de medição, vá para a razão da razão do objeto e selecione o coeficiente de Mander para configurar a via de colocalização no GA3 medindo a sobreposição de dois canais dentro de cílios individuais.
Arraste e solte o nó de coeficiente do Mander no espaço em branco e conecte-o ao binário e canais apropriados. ApEn as medidas e a tabela única abrindo o menu de gerenciamento de dados. Na categoria básica, selecione a coluna ApEn e clique em executar agora para medir cílios.
Todas as medidas aparecerão em uma única tabela de saída. As imagens representativas mostram que a IA treinada identificou adequadamente cílios in vitro nas imagens de células IMCD, culturas hipotalâmicas primárias e culturas hipocampais, mas nenhuma outra estrutura não ciliar, como pontes citocinéticas. O comprimento da cília variou de 0,5 a 4,5 micrômetros em células IMCD e de dois a 12 micrômetros na cultura hipotalâmica e hipocampal.
A IA mediu os comprimentos de AC3 rotulado cilia in vivo nas imagens do nosso núcleo arcuato, núcleo paraventricular e cornu ammonis uma região. De acordo com a análise, a cília hipotalâmica in vivo variou de um a 15 micrômetros, como visto em barras brancas e marrons. Enquanto cílios e a região de amonis de cornu variavam de um a 10 micrômetros, como visto em barras cinzas.
Curiosamente, a intensidade do Ciliar MCHR1 era mais forte no núcleo paraventricular do que no núcleo arcuato. As intensidades do MCHR1 contra o AC3 foram traçadas para medir sua sobreposição. A maioria dos cílios foram positivos para ambos os marcadores, enquanto alguns cílios foram positivos para AC3 ou MCHR1.
Para quantificar a colocalização do MTHR1 dentro do AC3, o coeficiente de sobreposição de Mander foi medido e houve um aumento significativo na sobreposição no núcleo paraventricular do que no núcleo arcuato. Para medir a intensidade ao longo do comprimento da cília, a polaridade cílio foi definida usando Centrin2-GFP como o marcador do corpo basal. Isso permitiu distinguir a base de cílios das pontas da cília positiva de cereja ARL13B-M.
Alterações na intensidade de ARL13B ao longo do comprimento da cília foram observadas onde a intensidade de ARL13B era maior na base do que na ponta do círio no núcleo arcuato, visto à esquerda, bem como PVN, como visto à direita. Ao analisar dados com essa abordagem, é importante ter certeza de que a qualidade e resolução do conjunto de dados experimentais é consistente com a usada para treinar IA. A principal utilidade dessa abordagem é que após a detecção de cilia por IA, o usuário pode ser criativo sobre quais propriedades são analisadas personalizando o fluxo de trabalho de análise integrado dentro do software.
