Mais de 50% dos pacientes com câncer colorretal desenvolvem metástase hepática através da disseminação da veia portal. E os modelos animais atuais para estudar metástase hepática de câncer colorretal permanecem inadequados para recapitular o processo biológico. A injeção de câncer colorretal fornece um ambiente tumoral rico em fibroblastos que permite a investigação do crosstalk entre células cancerígenas metastáticas e CAS em metástase hepática de câncer colorretal.
Esta técnica fornece uma plataforma para avaliar a eficácia das estratégias terapêuticas voltadas para o microambiente tumoral da metástase hepática do câncer colorretal. Este método é particularmente útil para investigar interações entre CAS, células tumorais e o microambiente tumoral. Se a ponta de algodão não for colocada corretamente no local da injeção, o sangramento excessivo pode ocorrer após a remoção da agulha.
A imersão da ponta de algodão pára assim que o local da injeção estiver localizado. Identificar a veia do portal e visualizar o local da injeção pode ser difícil sem demonstração visual deste procedimento. Para começar, prepare uma área cirúrgica asséptica usando cortinas estéreis em uma almofada de aquecimento.
Além disso, prepare todos os instrumentos necessários para a cirurgia, conforme descrito no manuscrito do texto. Em seguida, ilumine a área cirúrgica ajustando a posição da fonte de luz. Em seguida, injete subcutâneamente 0,1 miligramas por quilograma de peso corporal de buprenorfina em um camundongo para o tratamento da dor cirúrgica.
Em seguida, anestesiar o mouse e usar uma máquina de barbear elétrica, raspar o meio para o abdômen superior em uma área distante da área cirúrgica asséptica para evitar que o cabelo contamine o local. Limpe o local de incisão alternando com Betadine e 80% de etanol para esterilizar a área cirúrgica. Repita três vezes.
Coloque o mouse na área cirúrgica em uma almofada de aquecimento em uma posição supina com manutenção da anestesia isoflurane. Em seguida, coloque uma cortina cirúrgica com um buraco sobre seu abdômen. Levante a pele abdominal com fórceps e faça uma incisão de pele de dois a três centímetros na linha média com uma tesoura, cortando apenas a pele, certificando-se de que a incisão varia do abdômen médio ao processo xifoide do esterno e não acima da extremidade inferior do processo xifoide.
Em seguida, levante totalmente a parede peritifica com fórceps e faça uma incisão semelhante de dois a três centímetros ao peritônio com uma tesoura. Evite cortar o intestino e o diafragma. Em seguida, mergulhe uma gaze cirúrgica com soro fisiológico quente e coloque-a ao lado da incisão à direita do cirurgião.
Puxe suavemente os intestinos pequenos e grandes para fora usando um broto de algodão encharcado com soro fisiológico e coloque-os na gaze salina encharcada. Cubra os intestinos com gaze molhada adicional para mantê-los úmidos. Em seguida, puxe suavemente o intestino para a direita do cirurgião com a gaze molhada.
Em seguida, aplique uma tensão suave para visualizar a veia do portal. Se a visualização da veia portal for difícil, ajuste suavemente a posição do estômago com um broto de algodão molhado. Depois de canalizar suavemente a suspensão tumoróide várias vezes para obter uma suspensão celular homogênea, elabove 100 microlitres da suspensão celular em uma seringa Hamilton ou mililitro presa a uma agulha calibre 33, evitando bolhas de ar.
Insira lentamente o bisbisco da agulha na veia portal com uma profundidade de inserção de três a quatro milímetros e o ângulo da agulha quase paralelo à veia portal. Injete as células tumorais lentamente em 30 segundos para evitar a oclusão da veia portal. A cor do fígado muda temporariamente de vermelho para branco.
Após a injeção, remova a agulha lentamente e imediatamente aplique pressão suave no local da injeção com um broto de algodão seco por cinco minutos. Retire o broto de algodão e aplique imediatamente uma esponja hemostática no local da injeção. Segure a esponja com um broto de algodão ou fórceps e aplique pressão suave por mais cinco minutos.
Após cinco minutos, remova a pressão para a esponja hemostática e confirme que não há sangramento do local da injeção. Se ocorrer sangramento, realize imediatamente hemostasia de pressão com um broto de algodão por cerca de 10 minutos. Em seguida, aplique uma esponja hemostática adicional por mais cinco minutos.
Depois de confirmar que não há sangramento, remova as gazes cirúrgicas nos intestinos. Em seguida, usando uma seringa cheia de cinco mililitros de soro fisiológico, esguiche o soro fisiológico nos intestinos para evitar a adesão dos órgãos. Coloque suavemente os intestinos de volta dentro da cavidade abdominal e sutura o peritônio usando suturas de poliglactina 4-0.
Em seguida, levantando ambos os lados da pele com fórceps, aplique grampos de pele para fechar a incisão da pele, tomando cuidado para não grampear o intestino. Desligue o isoflurane, mas mantenha o fluxo de oxigênio funcionando. Monitore cuidadosamente o mouse.
E quando o rato acordar, coloque-o em uma gaiola vazia em uma almofada de aquecimento. Monitore o mouse até que ele esteja consciente e ambulando normalmente. Quatro horas após a cirurgia, injete subcutâneamente 0,1 miligramas por quilograma de buprenorfina.
Monitore cuidadosamente o mouse diariamente durante uma semana, verificando as suturas e a cicatrização da ferida. Sete a dez dias após a cirurgia, remova os grampeadores de pele usando um removedor de grampeador. RNA in situ hibridização duas semanas após a veia traseira AAV-8 Islr injeção mostrou superexpressão de Islr no fígado.
Duas semanas após a injeção de AAV mRuby2, suspensões de células únicas de organoides de câncer de cólon foram injetadas na veia portal do rato. Macroscopicamente, esta injeção de veia portal resultou em múltiplos nódulos tumorais brancos no fígado. A hematoxilina e a coloração de eosina das metástases hepáticas do câncer colorretal induzidas pela injeção de veia portal demonstraram histopatologia de adenocarcinoma tubular moderadamente diferenciado acompanhado de uma reação estromal desmoplástica e necrose.
Esta histologia rica em estroma fielmente recapitulava fielmente a das metástases hepáticas de câncer colorretal humano, tornando este modelo adequado para pesquisas translacionais que investigam o estromoma tumoral metastático. A imunohistoquímica para actina muscular suave alfa confirmou a presença de fibroblastos associados ao câncer, enquanto a coloração vermelha picro-Sirius demonstrou matriz extracelular abundante no tumor mesenchyme. A imunoquímica da EPCAM revelou que o câncer colorretal metastático mostrou brotamento tumoral, característica do câncer colorretal de prognóstico ruim.
E o índice de rotulagem Ki67 foi de aproximadamente 80% indicando que a maioria das células tumorais são mitoticamente ativas. Os camundongos apresentaram uma sobrevida mediana de 57 dias após a injeção tumoróide na veia portal. Os camundongos tratados com islr AAV-8 mostraram melhor sobrevivência do camundongo, diminuíram os sinais de imagem in vivo de tumores, aumentaram a sinalização de proteína morfogenética óssea e diminuíram as células proliferadoras de Ki67.
Certifique-se de que a ponta de algodão seja aplicada no local certo de injeção e a esponja hemostática só é aplicada depois que o sangramento parar. O estabelecimento do tumor pode ser monitorado usando a imagem IVIS para garantir que as células tumorais estejam crescendo dentro do fígado.
