Более чем у 50% больных колоректальным раком развиваются метастазы в печень через диссеминацию портальных вен. И современные животные модели для изучения метастазов колоректального рака в печени остаются недостаточными для повторения биологического процесса. Инъекция в воротные вены опухолей колоректального рака обеспечивает богатую фибробластами опухолевую среду, которая позволяет исследовать перекрестные помехи между метастатическими раковыми клетками и CAS при метастазировании колоректального рака печени.
Этот метод предоставляет платформу для оценки эффективности терапевтических стратегий, нацеленных на микроокружение опухоли при метастазировании колоректального рака печени. Этот метод особенно полезен для исследования взаимодействий между CAS, опухолевыми клетками и микроокружением опухоли. Если ватный наконечник неправильно помещен на место инъекции, после удаления иглы может возникнуть чрезмерное кровотечение.
Замачивание хлопкового наконечника прекращается, как только место инъекции находится. Идентификация воротной вены и визуализация места инъекции может быть затруднена без визуальной демонстрации этой процедуры. Для начала подготовьте асептическую хирургическую область с помощью стерильных штор на грелке.
Кроме того, подготовьте все инструменты, необходимые для операции, как описано в тексте рукописи. Затем осветите хирургическую область, отрегулировав положение источника света. Затем подкожно вводят 0,1 миллиграмма на килограмм массы тела бупренорфина в мышь для хирургического лечения боли.
Затем обезболивают мышь и с помощью электробритвы бреют середину до верхней части живота в области, удаленной от асептической хирургической области, чтобы избежать загрязнения участка волосами. Очистите место разреза, чередуя с бетадином и 80% этанолом для стерилизации хирургической области. Повторите три раза.
Поместите мышь в хирургическую зону на грелку в лежачем положении с поддержанием анестезии изофлураном. Затем поместите хирургическую драпировку с отверстием над животом. Поднимите кожу живота щипцами и сделайте двух-трехсантиметровый разрез кожи по средней линии ножницами, разрезая только кожу, убедившись, что разрез колеблется от середины живота до мечевидного отростка грудины и не выше нижнего конца мечевидного отростка.
Затем полностью поднимите стенку брюшины щипцами и сделайте ножницами аналогичный двух-трехсантиметровый разрез брюшины. Избегайте разрезания кишечника и диафрагмы. Затем замочите хирургическую марлю теплым физиологическим раствором и поместите ее рядом с разрезом справа от хирурга.
Аккуратно вытащите тонкий и толстый кишечник с помощью ватной палочки, пропитанной физиологическим раствором, и поместите их на пропитанную солевым раствором марлю. Накройте кишечник дополнительной влажной марлей, чтобы сохранить его влажным. Далее аккуратно потяните кишечник вправо от хирурга мокрой марлей.
Затем нанесите мягкое натяжение, чтобы визуализировать воротную вену. Если визуализация воротной вены затруднена, аккуратно скорректируйте положение желудка влажной ватной палочкой. После осторожного наложения суспензии опухолевой опухоли несколько раз для получения однородной клеточной суспензии, вытяните 100 микролитров клеточной суспензии в шприц Гамильтона или один миллилитровый шприц, прикрепленный к игле 33 калибра, избегая пузырьков воздуха.
Медленно вставьте иглу скосом вверх в воротную вену с глубиной введения от трех до четырех миллиметров и углом иглы почти параллельно портальной вене. Вводите опухолевые клетки медленно в течение 30 секунд, чтобы предотвратить окклюзию воротной вены. Цвет печени временно меняется с красного на белый.
После инъекции медленно извлеките иглу и сразу же нанесите мягкое давление на место инъекции сухой ватной палочкой в течение пяти минут. Снимите ватную палочку и сразу же нанесите гемостатическую губку на место инъекции. Подержите губку ватной палочкой или щипцами и мягко надавите еще пять минут.
Через пять минут снимите давление на гемостатическую губку и подтвердите, что кровотечения из места инъекции нет. При возникновении кровотечения немедленно выполняют гемостаз давлением ватной палочкой около 10 минут. Затем нанесите дополнительную гемостатическую губку еще на пять минут.
Подтвердив, что кровотечения нет, удаляют хирургические марли на кишечнике. Затем, используя шприц, наполненный пятью миллилитрами физиологического раствора, брызните физиологическим раствором в кишечник, чтобы предотвратить адгезию органов. Аккуратно поместите кишечник обратно внутрь брюшной полости и зашить брюшину с помощью 4-0 полиглактиновых швов.
Затем подтягивая обе стороны кожи щипцами, нанесите степлеры кожи, чтобы закрыть разрез кожи, стараясь не скрепить кишечник. Выключите изофлуран, но поддерживайте поток кислорода. Внимательно следите за мышью.
А когда мышь проснется, поместите ее в пустую клетку на грелку. Следите за мышью до тех пор, пока она не станет в сознании и нормально амбулирует. Через четыре часа после операции подкожно вводят 0,1 миллиграмма на килограмм бупренорфина.
Тщательно следите за мышью ежедневно в течение недели, проверяя швы и заживление ран. Через семь-10 дней после операции удалите степлеры кожи с помощью степлера. Гибридизация РНК in situ через две недели после инъекции AAV-8 Islr в хвостовую вену показала гиперэкспрессию Islr в печени.
Через две недели после инъекции AAV mRuby2 одноклеточные суспензии органоидов рака толстой кишки были введены в воротную вену мыши. Макроскопически эта инъекция в воротную вену привела к множественным белым опухолевым узелкам в печени. Окрашивание гематоксилином и эозином колоректального рака печеночных метастазов, индуцированных инъекцией воротной вены, продемонстрировало гистопатологию умеренно дифференцированной канальцевой аденокарциномы, сопровождающейся десмопластической стромальной реакцией и некрозом.
Эта богатая стромой гистология точно повторила метастазы колоректального рака человека в печени, что делает эту модель подходящей для трансляционных исследований, исследующих метастатическую опухолевую строму. Иммуногистохимия альфа-гладкомышечного актина подтвердила наличие связанных с раком фибробластов, тогда как красное окрашивание Пикро-Сириуса продемонстрировало обильное внеклеточное матрикс в мезенхиме опухоли. Иммунохимия для EPCAM показала, что метастатический колоректальный рак показал почкование опухоли, что характерно для плохого прогноза колоректального рака.
А индекс маркировки Ki67 составил примерно 80%, что указывает на то, что большинство опухолевых клеток митотически активны. Мыши показали среднюю выживаемость через 57 дней после инъекции опухоли в воротную вену. Мыши, получавшие AAV-8 Islr, показали улучшенную выживаемость мышей, снижение сигналов визуализации in vivo от опухолей, увеличение передачи сигналов костного морфогенетического белка и снижение пролиферирующих клеток Ki67.
Убедитесь, что ватный наконечник приложен к правильному месту инъекции, а гемостатическая губка применяется только после остановки кровотечения. Создание опухоли можно контролировать с помощью визуализации IVIS, чтобы убедиться, что опухолевые клетки растут в печени.
