肝転移間質を研究するための結腸直腸癌オルガノイドの門脈注入

結腸直腸癌患者の50%以上が門脈播種を介して肝転移を発症する。そして、結腸直腸癌肝転移を研究するための現在の動物モデルは、生物学的プロセスを再現するには不十分なままである。結腸直腸癌ポノノイドの門脈注入は、結腸直腸癌肝転移における転移癌細胞とCASとの間のクロストークの調査を可能にする線維芽細胞に富む腫瘍環境を提供する。

この技術は、結腸直腸癌肝転移の腫瘍微小環境を標的とする治療戦略の有効性を評価するためのプラットフォームを提供する。この方法は、CAS、腫瘍細胞、および腫瘍微小環境との間の相互作用を調べるのに特に有用である。綿の先端が注射部位に正しく置かれていない場合、針を抜いた後に過度の出血が起こることがあります。

綿の先端の浸漬は、注射部位が見つかったら停止する。門脈を同定し、注射部位を視覚化することは、この手順の視覚的なデモンストレーションなしには困難な場合がある。まず、加熱パッド上の滅菌ドレープを使用して無菌手術領域を準備する。

さらに、テキスト原稿に記載されているように、手術に必要なすべての器具を準備します。次に、光源の位置を調整して手術領域を照らす。次に、外科的疼痛管理のために、ブプレノルフィンの体重1kgあたり0.1ミリグラムをマウスの皮下注射する。

次に、マウスを麻酔し、電気シェーバーを使用して、無菌手術領域から離れた領域で中腹部から上腹部を剃り、毛髪が部位を汚染するのを避ける。切開部位をベタジンと80%エタノールで交互に洗浄し、手術領域を滅菌する。これを3回繰り返します。

イソフルラン麻酔のメンテナンスで仰臥位で加熱パッド上の手術領域にマウスを置きます。次に、腹部に穴を開けた外科用ドレープを置きます。鉗子で腹部皮膚を持ち上げ、はさみで正中線に2〜3センチメートルの皮膚切開を行い、皮膚のみを切断し、切開部が中腹部から胸骨の剣状突起までの範囲であり、剣状突起の下端より上ではないことを確認する。

その後、鉗子で腹膜壁を完全に持ち上げ、はさみで腹膜に同様の2〜3センチメートルの切開を行います。腸や横隔膜を切らないでください。次に、外科用ガーゼを温かい生理食塩水で浸し、外科医の右側の切開部の隣に置きます。

生理食塩水で浸した綿棒を使って大腸をそっと引き出し、生理食塩水を浸したガーゼの上に置きます。腸を湿ったガーゼで覆い、湿らせます。次に、濡れたガーゼで腸を外科医の右にそっと引きます。

次に、穏やかな張力を加えて門脈を視覚化します。門脈の可視化が困難な場合は、濡れた綿芽で胃の位置を静かに調整してください。腫瘍様懸濁液を穏やかに数回配管して均質な細胞懸濁液を得た後、気泡を避けて、100マイクロリットルの細胞懸濁液を33ゲージ針に取り付けられたハミルトンまたは1ミリリットルのシリンジに引き込む。

針のベベルを門脈にゆっくりと挿入し、挿入深さが3〜4ミリメートルで、針角度が門脈とほぼ平行になります。門脈の閉塞を防ぐために、腫瘍細胞を30秒かけてゆっくりと注入する。肝臓の色は一時的に赤から白に変わります。

注射後、ゆっくりと針を外し、すぐに乾燥した綿芽で注射部位に5分間穏やかな圧力をかけます。綿棒を取り除き、直ちに止血スポンジを注射部位に塗布する。綿のつぼみまたは鉗子でスポンジを持ち、さらに5分間穏やかな圧力をかけます。

5分後、止血スポンジへの圧力を取り除き、注射部位からの出血がないことを確認する。出血が発生した場合は、直ちに綿芽で約10分間圧止血を行う。その後、追加の止血スポンジをさらに5分間塗布する。

出血がないことを確認した後、腸の外科用ガーゼを取り外します。次に、5ミリリットルの生理食塩水で満たされた注射器を使用して、生理食塩水を腸に噴き出し、臓器の癒着を防ぐ。腸を腹腔内に静かに戻し、4-0ポリグラクチン縫合糸を使用して腹膜を縫合する。

次に、鉗子で皮膚の両側を持ち上げ、皮膚のステープラーを塗布して皮膚切開部を閉じ、腸をホチキス止めしないように注意してください。イソフルランをオフにしますが、酸素の流れは流れたままにします。マウスを注意深く監視します。

そしてマウスが目を覚ましたら、それを加熱パッドの空のケージに入れます。マウスが意識が良くなり、正常に歩行できるようになるまでマウスを監視します。術後4時間後、ブプレノルフィン1kgあたり0.1ミリグラムを皮下注射する。

マウスを1週間毎日注意深く監視し、縫合糸と創傷治癒を確認してください。手術後7〜10日目に、ステープラーリムーバーを用いて皮膚ステープラーを除去する。RNAin situハイブリダイゼーションの2週間後に尾静脈AAV−8 Islr注射は肝臓におけるIslrの過剰発現を示した。

AAV mRuby2注射の2週間後、大腸癌オルガノイドの単一細胞懸濁液をマウス門脈に注射した。巨視的には、この門脈注射は肝臓に複数の白色腫瘍結節をもたらした。門脈注入により誘導された大腸癌肝転移のヘマトキシリンおよびエオジン染色は、デスモプラスティック間質反応および壊死を伴う中分化性尿細管腺癌の組織病理学を実証した。

この間質が豊富な組織学は、ヒト大腸癌肝転移の組織学を忠実に再現し、転移性腫瘍間質を調査するトランスレーショナルリサーチに適したモデルとなった。アルファ平滑筋アクチンの免疫組織化学は癌関連線維芽細胞の存在を確認したが、ピクロシリウス赤色染色は腫瘍間葉系に豊富な細胞外マトリックスを示した。EPCAMの免疫化学により、転移性結腸直腸癌は腫瘍出芽を示し、これは予後不良の結腸直腸癌の特徴であることを明らかにした。

そして、Ki67標識指数は約80%であり、ほとんどの腫瘍細胞が有糸分裂活性であることを示している。マウスは、門脈への腫瘍様注射後57日間の生存期間中央値を示した。AAV-8 Islr処理マウスは、マウスの生存率の改善、腫瘍からのin vivoイメージングシグナルの減少、骨形成タンパク質シグナル伝達の増強、およびKi67増殖細胞の減少を示した。

綿の先端が正しい注射部位に塗布され、止血スポンジが出血が止まった後にのみ適用されることを確認してください。腫瘍の樹立は、IVISイメージングを使用してモニタリングし、腫瘍細胞が肝臓内で増殖していることを確認することができる。