El método ayuda en el estudio de la señalización mecánica de las células de la cresta neural y su interacción con las señales químicas. También puede ayudar en los mecanismos moleculares y genéticos del desarrollo de la cresta neural en enfermedades. Transferir los resbalones de la cubierta de vidrio es lo más difícil, por lo tanto, transfiéralos lenta y atentamente para evitar que se rompan y caigan.
Demostrando el procedimiento seremos yo y la Dra. Sherry Zhao, becaria postdoctoral de mi laboratorio. Comience colocando el número deseado de resbalones de cubierta de vidrio en un trozo de toallita de laboratorio. Luego esterilice cada deslizamiento de la cubierta pasándolo de un lado a otro a través de la llama del quemador de alcohol.
Cuando la cubierta se deslice se enfríe, cubra el deslizamiento de la cubierta de 12 milímetros con aproximadamente 200 microlitros y el deslizamiento de la cubierta de 25 milímetros con 800 microlitros de hidróxido de sodio molar 0.1. Después de cinco minutos, aspire el hidróxido de sodio y deje que los resbalones de la cubierta se sequen al aire durante cinco minutos para formar una película uniforme. Una vez que se sequen los resbalones de la cubierta, agregue aproximadamente 18 microlitros de aminopropil trietoxisilano o APTS en un resbalón de cubierta de 12 milímetros y 150 microlitros de APTS en un resbalón de cubierta de 25 milímetros.
Aspirar el acceso APTS para permitir que el APTS residual se seque durante cinco minutos. Más tarde, enjuague los deslizamientos de la cubierta tres veces sumergiéndolos en agua desionizada estéril durante cinco minutos cada vez. Mueva los resbalones de la cubierta lavada a una placa de Petri fresca con el lado reactivo hacia arriba.
Y trate los resbalones de la cubierta remojando suficiente glutaraldehído al 0,5% durante 30 minutos. Después de aspirar el glutaraldehído, enjuague los resbalones de la cubierta una vez con agua desionizada durante tres minutos y seque al aire los resbalones de la cubierta con el lado reactivo hacia arriba. Para preparar los resbalones de cubierta siliconados, coloque el mismo número de resbalones de cubierta que los resbalones de cubierta recubiertos de aminosilano en una placa de Petri forrada con para película.
Luego, trate los deslizamientos de cubierta de 12 milímetros con 40 microlitros y los deslizamientos de cubierta de 25 milímetros con 150 microlitros de silano de diclorometano o DCMS durante cinco minutos. Lave los resbalones de la cubierta con agua desionizada estéril una vez durante un minuto antes de colocar los resbalones de la cubierta reactiva boca arriba en una toallita de laboratorio. Para preparar los hidrogeles, pipetee la solución de gel de acrilamida recién preparada sobre los resbalones de la cubierta recubierta de aminosilano seco.
Usando pinzas curvas, transfiera inmediatamente el deslizamiento de la cubierta tratada con DCMS sobre la solución de gel con el lado tratado tocando la solución de gel, intercalando así cambiar la solución de gel entre dos deslizamientos de cubierta. Una vez polimerizado el gel, separe el deslizamiento de la cubierta tratada con DCMS con pinzas curvas, dejando el gel unido al deslizamiento de la cubierta recubierta de aminosilano. A continuación, sumerja el resbalón de la cubierta de 12 milímetros con el hidrogel conectado en una placa predeterminada de 4 o 24 pocillos cubierta con 500 microlitros de PBS estéril o agua desionizada y el deslizamiento de la cubierta de 25 milímetros en una placa de 6 pocillos cubierta con dos mililitros de PBS estéril o agua desionizada durante 30 minutos.
Después de eliminar el exceso de solución de acrilamida, guarde los hidrogeles en PBS estéril o agua desionizada a temperatura ambiente durante 30 minutos. Más tarde, aspire PBS o agua desionizada de la placa del pozo antes de agregar la solución de Sulfo-succinimidil o Sulfo-SUNPAH para cubrir el gel por completo. Y coloque los geles con la solución bajo una luz ultravioleta de 15 vatios y 365 nanómetros descubierta durante 10 minutos.
Recolecte la mayor cantidad posible de Sulfo-SANPAH por solución inclinando la placa. Y luego lave el gel dos o tres veces con HEPES de 15 milimolares. Añadir 15 miligramos por mililitro de colágeno 1 diluido en ácido acético al 0,2% a cada pocillo que contenga el hidrogel.
E incubar los geles durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, realice el lavado como se describe en el manuscrito antes de incubar los hidrogeles con PBS que contiene 10% de suero de caballo y 5% de FBS a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Después de dos horas de incubación, agregue 500 microlitros de DMEM filtrado estéril con 10% FBS y 1% de estreptomicina de penicilina a cada pozo y almacene los geles a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.
Cuando el cultivo celular esté listo, placa aproximadamente 1.5 veces 10 a la cuarta 09-1 células por centímetro cuadrado en el medio bazell. Use pinzas para transportar los resbalones de la cubierta a una nueva placa para minimizar las señales falsas de las células que crecen directamente en la placa. Luego, fije las células usando 500 microlitros de 4% de paraformaldehído durante 10 minutos antes de tratar las células con 500 microlitros de 0.1% Triton X-100 a temperatura ambiente.
Después de 15 minutos, camine las células con 250 microlitros de suero de burro al 10%. Teñir las células para F-actina con felodipina a una dilución de 1 a 400 en 250 microlitros de suero de burro al 10%, seguido de incubación con DAPI durante 10 minutos. Lave las células con PBS durante dos minutos antes de agregar de tres a cuatro gotas de medio de montaje a cada pozo.
En un microscopio de fluorescencia, capture las imágenes de al menos tres fotogramas aleatorios por muestra de hidrogel que produce canales individuales y combinados. En la evaluación de la rigidez del hidrogel a través de microscopía de fuerza atómica o AFM, la pendiente de la curva de fuerza fue suave para los hidrogeles blandos ya que la fuerza requerida de la sonda AFM fue menor. Sin embargo, en hidrogeles rígidos, la pendiente generada fue mucho más pronunciada.
Las mediciones de AFM se utilizaron para calcular la rigidez promedio de los hidrogeles del módulo elástico de Young en kilopascales. Las características de crecimiento de las células P19 y 09-1 se observaron en hidrogeles de un kilopascale y 40 kilopascales de control y gel modificado. Las células 09-1 cultivadas en los sistemas de gel originales dieron como resultado un mayor número de células muertas.
En contraste, las células 09-1 cultivadas en los sistemas de gel modificado exhibieron un crecimiento celular saludable y suficiente unión al sustrato de hidrogeles con poca cubierta celular indicada por células redondas mínimas. Las células P19 chapadas en ambos sistemas de hidrogel mostraron un exceso de células flotantes redondas y una falta de accesorios de sustrato celular. La compatibilidad de las células de la cresta neural o NCC con el sistema de hidrogel modificado se evaluó mediante tinción inmunofluorescente para AP-2.
Se observó un aumento significativo en la expresión de AP-2 en células 09-1 chapadas en el sistema de hidrogel modificado. Además, las células 09-1 exhibieron diferentes morfologías basadas en los hidrogeles de baja o alta rigidez a través de cantidades variables de las fibras de estrés. La expresión de anti-vinculina en 09-1 células cultivadas en el hidrogel de 40 kilopascales fue mayor que las cultivadas en el hidrogel de un kilopascale, lo que refleja que las células cultivadas en sustratos más blandos forman complejos de adición focal mínimos que el sustrato rígido.
El tiempo de espera adecuado es crucial para la polimerización de los hidrogeles, ya que las acrilamidas son tóxicas para las células. Sumerja los hidrogeles en PBS o agua desionizada durante al menos 30 minutos para garantizar mejores resultados.
