この方法は、神経堤細胞の機械的シグナル伝達と化学シグナルとの相互作用の研究に役立つ。また、疾患における神経堤の発達の分子および遺伝的メカニズムを助けることができる。ガラスカバースリップを転送することは最も困難であるため、それらを壊して落とさないようにゆっくりと注意深く転送します。
この手順を実証することは、私と私の研究室の博士研究員であるシェリー・ジャオ博士です。まず、所望の数のガラスカバースリップを実験室のワイプの上に置くことから始めます。その後、アルコールバーナーの炎を通して前後に通過させることによって、各カバースリップを殺菌します。
カバーが冷めると、約200マイクロリットル、25ミリメートルカバースリップでカバースリップをカバーし、800マイクロリットルの0.1モル水酸化ナトリウムをカバーします。5分後、水酸化ナトリウムを吸引し、カバースリップを5分間空気乾燥させて均一なフィルムを形成する。カバースリップが乾燥したら、12ミリメートルカバースリップに約18マイクロリットルのアミノプロピルトリエトキシシランまたはAPTSを加え、25ミリメートルカバースリップにAPTSを150マイクロリットル加えます。
吸気アクセスAPTSは、残留APTSが5分間乾燥することを可能にする。その後、滅菌脱イオン水にそれぞれ5分間浸して、カバーを3回すすいでください。洗ったカバースリップを新鮮なペトリ皿に移し、反応性側を上に向けます。
そして、カバースリップを30分間十分な0.5%グルタルアルデヒドに浸して治療します。グルタルアルデヒドを吸引した後、カバースリップを脱イオン水で3分間一度すすいで、反応性側を上げてカバースリップを空気乾燥させます。シリコン化カバースリップを準備するには、パラフィルムが並ぶペトリ皿にアミノシランコーティングカバースリップと同数のカバースリップを配置します。
その後、12ミリメートルのカバースリップを40マイクロリットルで、25ミリメートルのカバースリップを150マイクロリットルのジクロロメタンシランまたはDCMSで5分間処理します。反応性カバースリップを実験室の拭き取りに上に置く前に、滅菌脱イオン水でカバースリップを1分間1回洗います。ヒドロゲルを調製するために、ピペットは乾燥したアミノシラン被覆伝票上に作りたてのアクリルアミドゲル溶液を作製した。
湾曲したピンセットを使用して、処理された側がゲル溶液に触れ、2つのカバースリップ間でゲル溶液を挟み込んで、直ちにDCMS処理カバースリップをゲル溶液の上に移す。ゲルが重合されたら、DCMS処理カバースリップを湾曲したピンセットで分離し、ゲルをアミノシランコーティングカバースリップに取り付けたままにします。次に、12ミリメートルのカバースリップを、500マイクロリットルの無菌PBSまたは脱イオン水で覆われた所定の4ウェルまたは24ウェルプレートに付いたヒドロゲルと共に、2ミリリットルの無菌PBSまたは脱イオン水で覆われた6ウェルプレートに30分間沈殿します。
過剰なアクリルアミド溶液を除去した後、ヒドロゲルを滅菌PBSまたは脱イオン水で室温で30分間保存します。その後、ゲルを完全に覆うためにスルフォ・スクシニマイジルまたはスルフォ-SUNPAH溶液を添加する前に、PBSまたはウェルプレートから脱イオン水を吸引した。そして、15ワット、365ナノメートルの紫外線の下に溶液とゲルを10分間覆います。
プレートを傾けることによって溶液ごとのSulfo-SANPAHのできるだけ多くを集める。そして、ゲルを15ミリモルHEPESで2〜3回洗浄します。1ミリリットル当たり15ミリグラムを加えるコラーゲン1を0.2%酢酸で希釈し、ヒドロゲルを含む各ウェルに。
そして、摂氏37度と5%の二酸化炭素で一晩ゲルをインキュベートします。翌日、37°Cおよび5%の二酸化炭素で10%馬血清および5%FBSを含むPBSでヒドロゲルをインキュベートする前に、原稿に記載されているとおりに洗浄を行う。2時間のインキュベーションの後、10%FBSと1%ペニシリンストレプトマイシンを用いた無菌濾過DMEMの500マイクロリットルを各ウェルに加え、ゲルを摂氏37度と5%の二酸化炭素で保存します。
細胞培養が整うまで、約10〜4番目の09〜1細胞をバゼル培地で2乗にしてプレートします。ピンセットを使用してカバースリップを新しいプレートに輸送し、プレート上で直接成長した細胞からの偽信号を最小限に抑えます。次いで、500マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドを10分間使用して細胞を固定してから、室温で500マイクロリットルの0.1%トリトンX-100で細胞を処理します。
15分後、10%ロバ血清の250マイクロリットルで細胞を歩きます。フェロジピンでF-アクチンの細胞を10%ロバ血清の250マイクロリットルで1〜400の希釈で染色し、続いてDAPIを10分間インキュベートする。各ウェルに3〜4滴の取り付け培地を加える前に、PBSで細胞を2分間洗います。
蛍光顕微鏡では、個々のチャネルと結合チャネルを生成するヒドロゲルサンプルあたり少なくとも3つのランダムフレームの画像をキャプチャします。原子間力顕微鏡またはAFMによるヒドロゲルの剛性評価では、AFMプローブからの必要な力が少なかったため、力曲線の傾きは軟質ヒドロゲルにとって緩やかであった。しかし、硬いヒドロゲルでは、生成された斜面ははるかに急でした。
AFM測定は、ヤングの弾性率からキロパスカルでのヒドロゲルの平均剛性を計算するために使用されました。P19および09-1細胞の増殖特性は、制御および改変ゲル系の1キロパスカルおよび40キロパスカルヒドロゲルで観察された。元のゲル系で増殖した09-1細胞は、死んだ細胞の数が多くなった。
対照的に、改変ゲル系で増殖した09-1細胞は、最小限の丸い細胞で示される小さな細胞甲板を有するヒドロゲル基板への健全な細胞増殖および十分な付着を示した。両方のヒドロゲル系にメッキされたP19細胞は、過剰な丸い浮遊細胞と細胞基板のアタッチメントの欠如を示した。修飾されたヒドロゲル系との神経堤細胞またはNCCの相溶性を、AP−2に対する免疫蛍光染色法によって評価した。
修飾されたヒドロゲル系上でめっきされた09-1細胞におけるAP−2発現の有意な増加が観察された。さらに、09-1細胞は、ストレス繊維の様々な量を通じて低剛性ヒドロゲルまたは高剛性ヒドロゲルに基づいて異なる形態を示した。40キロパスカルヒドロゲルで増殖した09-1細胞における抗ビンクリン発現は、軟質基質上で増殖した細胞が硬質基質よりも最小限の焦点付加複合体を形成することを反映して、1キロパスカルヒドロゲルで増殖したものよりも高かった。
アクリルアミドが細胞に有毒であるため、ヒドロゲルの重合には適切な待ち時間が重要です。より良い結果を確実にするために、少なくとも30分間、水をPBSまたは脱イオン水に浸します。
