Yöntem, nöral kret hücrelerinin mekanik sinyallerinin ve kimyasal sinyallerle etkileşiminin incelenmesine yardımcı olur. Ayrıca hastalıklarda nöral kret gelişiminin moleküler ve genetik mekanizmalarına yardımcı olabilir. Cam kapak kaymalarını aktarmak en zor olanıdır, bu nedenle kırılmalarını ve düşmelerini önlemek için yavaşça ve dikkatlice aktarın.
Prosedürü gösteren ben ve laboratuvarımdan doktora sonrası bir adam olan Dr. Sherry Zhao olacak. İstediğiniz sayıda cam kapak fişini bir laboratuvar mendili parçasına yerleştirerek başlayın. Daha sonra her kapak kaymasını alkol yakıcının alevinden ileri geri geçirerek sterilize edin.
Kapak kaydığında, 12 milimetrelik kapak kaymasını yaklaşık 200 mikrolitre ve 25 milimetre kapak kaymasını 800 mikrolitre 0,1 molar sodyum hidroksit ile örtün. Beş dakika sonra, sodyum hidroksit aspire edin ve kapak kaymalarının eşit bir film oluşturmak için beş dakika boyunca kurumasını bekleyin. Kapak kaymaları kuruduktan sonra, 12 milimetrelik bir kapak kaymasına yaklaşık 18 mikrolitre aminopropil triethoxysilane veya APTS ve 25 milimetrelik kapak kaymasına 150 mikrolitre APTS ekleyin.
Artık APTS'nin beş dakika kurumasını sağlamak için APTS'ye erişim apireti yapın. Daha sonra, kapak kaymalarını her seferinde beş dakika steril deiyonize suya batırarak üç kez durulayın. Yıkanmış kapak kaymalarını, reaktif tarafı yukarı bakacak şekilde taze bir Petri kabına taşıyın.
Ve kapak kaymalarını 30 dakika boyunca yeterli% 0.5 glutaraldehit içine batırarak tedavi edin. Glutaraldehiti aspire ettikten sonra, kapak kaymalarını üç dakika boyunca deiyonize suyla bir kez durulayın ve kapak kaymalarını reaktif tarafı yukarı bakacak şekilde kurulayın. Silikon kaplı kapak kaymalarını hazırlamak için, aminosilane kaplı kapak kaymaları para filmi ile kaplı bir Petri kabına kaydığı için eşit sayıda kapak kayması yerleştirin.
Daha sonra, 12 milimetrelik kapak kaymalarını 40 mikrolitre ve 25 milimetre kapak kaymalarını 150 mikrolitre dikloromethane silane veya DCMS ile beş dakika boyunca tedavi edin. Reaktif kapak kaymalarını laboratuvar silme işlemine yüzüstü yerleştirmeden önce kapak kaymalarını steril deiyonize suyla bir dakika boyunca yıkayın. Hidrojelleri hazırlamak için pipet, kurutulmuş aminosilane kaplı kapak kaymalarına taze hazırlanmış akrilamid jel çözeltisi.
Kavisli cımbız kullanarak, DCMS işlem görmüş kapak fişini jel çözeltisinin üzerine derhal aktarın ve işlenmiş taraf jel çözeltiye dokunur, böylece jel çözeltisini iki kapak kayması arasında değiştirin. Jel polimerize edildikten sonra, DCMS işlem görmüş kapak kaymasını kavisli cımbızla ayırın ve jeli aminosilane kaplı kapak kaymasına bağlı bırakın. Daha sonra, 12 milimetrelik kapak kaymasını önceden belirlenmiş 4 kuyulu veya 24 kuyulu bir plaka ile 500 mikrolitre steril PBS veya deiyonize su ile kaplanmış ve 25 milimetrelik kapak kaymasını 30 dakika boyunca iki mililitre steril PBS veya deiyonize su ile kaplı 6 kuyulu bir plakaya batırın.
Fazla akrilamid çözeltisini çıkardıktan sonra, hidrojelleri steril PBS veya deiyonize suda oda sıcaklığında 30 dakika saklayın. Daha sonra, jeli tamamen örtmek için Sulfo-succinimydyl veya Sulfo-SUNPAH çözeltisi eklemeden önce kuyu plakasından PBS veya deiyonize su epire edin. Ve çözeltili jelleri 10 dakika boyunca açık 15 watt, 365 nanometre ultraviyole ışığın altına yerleştirin.
Plakayı yatırarak çözelti başına mümkün olduğunca Sulfo-SANPAH toplayın. Ve sonra jeli 15 milimolar HEPES ile iki ila üç kez yıkayın. Hidrojel içeren her kuyuya mililitre başına 15 miligram ekleyin Kollajen 1% 0.2 asetik asitte seyreltilmiş.
Ve jelleri bir gecede 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatır. Ertesi gün, hidrojelleri% 10 at serumu ve 37 Santigrat'ta% 5 FBS ve% 5 karbondioksit içeren PBS ile kuluçkaya yatırmadan önce el yazmasında açıklandığı gibi yıkamayı gerçekleştirin. İki saatlik inkübasyondan sonra, her kuyuya%10 FBS ve %1 penisilin streptomisi ile 500 mikrolitre steril filtreli DMEM ekleyin ve jelleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte saklayın.
Hücre kültürü hazır olduğunda, bazell ortamında santimetre başına yaklaşık 1,5 çarpı 10 ila dördüncü 09-1 hücreyi plakalayın. Doğrudan tabağa yetiştirilen hücrelerden gelen yanlış sinyalleri en aza indirmek için kapak kaymalarını yeni bir tabağa taşımak için cımbız kullanın. Daha sonra, 500 mikrolitre %4 paraformaldehit kullanarak hücreleri oda sıcaklığında %0,1 Triton X-100'lük 500 mikrolitre ile tedavi etmeden önce 10 dakika sabitleyin.
15 dakika sonra, % 10 eşek serumunun 250 mikrolitresi ile hücreleri gezdirin. F-actin hücrelerini% 10 eşek serumunun 250 mikrolitresinde 1 ila 400 seyreltmede felodipinin ile lekeleyin, ardından 10 dakika boyunca DAPI ile inkübasyon yapın. Her kuyuya üç ila dört damla montaj ortamı eklemeden önce hücreleri PBS ile iki dakika yıkayın.
Floresan mikroskopta, hidrojel numune başına en az üç rastgele karenin görüntülerini yakalayın ve bireysel ve birleştirilmiş kanallar üretin. Hidrojelin atomik kuvvet mikroskopisi veya AFM yoluyla sertlik değerlendirmesinde, AFM probundan gerekli kuvvet daha az olduğu için kuvvet eğrisinin eğimi yumuşak hidrojeller için yumuşaktı. Bununla birlikte, sert hidrojellerde, üretilen eğim çok daha dikti.
AFM ölçümleri daha sonra Young'ın kilopaskallerdeki elastik modülünden hidrojellerin ortalama sertliğini hesaplamak için kullanıldı. P19 ve 09-1 hücrelerinin büyüme özellikleri bir kilopaskal ve 40 kilopaskal hidrojel kontrol ve modifiye jel sistemlerinde gözlendi. Orijinal jel sistemlerinde yetişen 09-1 hücreleri daha fazla sayıda ölü hücre ile sonuçlandı.
Buna karşılık modifiye jel sistemlerinde yetişen 09-1 hücreleri sağlıklı hücre büyümesi ve minimum yuvarlak hücrelerle belirtilen az hücre destesi ile hidrojel substrata yeterli bağlanma gösterdi. Her iki hidrojel sistemde de kaplanmış P19 hücreleri, yuvarlak yüzen hücrelerin fazlalığını ve hücre substrat ataşmanlarının eksikliğini gösterdi. Nöral kret hücrelerinin veya NCC'lerin modifiye hidrojel sistemi ile uyumluluğu AP-2 için immünoflooresan boyama ile değerlendirildi.
Modifiye hidrojel sistem üzerine kaplanmış 09-1 hücrede AP-2 ekspresyonunda anlamlı bir artış gözlenmiştir. Ek olarak, 09-1 hücreleri, stres liflerinin değişen miktarları aracılığıyla düşük veya yüksek sertlikteki hidrojellere dayanan farklı morfolojiler sergiledi. 40 kilopaskal hidrojel üzerinde yetiştirilen 09-1 hücredeki anti-vinkülin ekspresykülü, daha yumuşak substratlarda yetişen hücrelerin sert substrattan minimum odak ekleme kompleksleri oluşturduğunu yansıtan bir kilopaskal hidrojelde yetişenlerden daha yüksekti.
Akrilamidler hücreler için toksik olduğu için hidrojellerin polimerizasyonu için uygun bekleme süresi çok önemlidir. Daha iyi sonuçlar elde etmek için hidrojelleri PBS veya deiyonize suya en az 30 dakika batırın.
