La línea celular O9-1 es una herramienta muy útil para estudiar las células de la cresta neural in vitro. Tiene un gran potencial para su uso en una amplia gama de aplicaciones en varios usos de la investigación. Las células O9-1 tienen ventajas obvias, como el fácil acceso, y la obtención rápida de números de células suficientes para experimentos, por lo que es un método poderoso complementario a los estudios in vitro de las células de la cresta neural.
Para empezar, prepare medios basales para el cultivo celular O9-1, de acuerdo con el protocolo de texto. Luego, filtre el medio basal y envuélvalo en papel de aluminio para protegerlo de la luz. Después de esto, recoja los medios basales condicionados de una célula STO activada de acuerdo con el protocolo de texto.
En primer lugar, descongelar una alícuota de matriz de membrana del sótano sobre hielo durante dos horas. A continuación, diluir la matriz de membrana del sótano con DMEM esterilizado filtrado con 10%FBS a una concentración final de 0,5mg/ml. Recubrir la placa con la matriz de membrana del sótano a temperatura ambiente durante una hora.
A continuación, aspirar la matriz de membrana del sótano mientras se inclina la placa. Seque las placas a 30 grados centígrados durante 30 minutos. Al agregar la matriz de membrana del sótano a la placa, asegúrese de que la solución cubra el pozo uniformemente para mantener las características celulares y evitar variaciones innecesarias entre experimentos.
Recuperar células O9-1 mediante la colocación de un crio-vial en un baño de agua Celsius de 37 grados. Gire lentamente el vial hasta que la solución se vuelva completamente líquida. Después de esto, transfiera la solución celular del crio-vial a un tubo centrífugo de 15 ml.
Agregue cinco volúmenes de DMEM con 10%FBS al tubo para volver a suspender las células. Centrifugar las células durante tres minutos a 180 Gs.Then, aspirar al sobrenadante, teniendo cuidado de no molestar el pellet. A continuación, vuelva a suspender el pellet en medios basales acondicionados complementados con LIF y BFGF.
Siembra las células en una placa de seis pozos, y agita la placa para sembrar las células uniformemente. Al agitar la placa, hágalo horizontal y verticalmente, ya que arremolinar la placa hará que las células se concentren hacia el centro. Y permita que esas células se adhieran y crezcan en una incubadora de cultivo celular estándar durante la noche.
Asegúrese de que las celdas estén conectadas antes de cambiar el medio. Cuando las células O9-1 alcanzan el 80% de confluencia, descongele la matriz de membrana del sótano y prepare una placa recubierta de matriz de membrana de sótano como se describió anteriormente. A continuación, agregue medios basales complementados con LIF y BFGF a la matriz de membrana.
Enjuague suavemente los pozos con 2 ml de DPBS dos veces. Luego, disociar las células con 1ml de 0.05%trypsin EDTA a 37 grados Celsius durante tres minutos. Neutralizar la tripina con una cantidad igual de DMEM con 10%FBS pipeteando repetidamente el líquido sobre toda la superficie del pozo.
A continuación, transfiera la solución celular a un tubo centrífugo. Y centrifugar durante tres minutos a 180 Gs.Aspirar al sobrenadante sin alterar el pellet de las células. A continuación, resuspender el pellet celular por pippetting medios basales acondicionados complementados con LIF y BFGF.
Siembra las células a la placa recubierta como se describió anteriormente. Luego, permita que las células se adhieran y crezcan en una incubadora de cultivo celular estándar. En primer lugar, prepare los medios de congelación 2X de acuerdo con el protocolo de texto.
A continuación, esteriliza el medio. Enjuague las paredes de la placa con DPBS dos veces, pipeteando suavemente para evitar la pérdida de células. A continuación, disociar las células con 0.05%trypsin EDTA a 37 grados Celsius durante tres minutos.
Neutralizar la tripina con una cantidad igual de 10%FBS y DMEM. Transfiera el contenido de la placa a un tubo centrífugo, y centrifugar durante tres minutos a 180 Gs.Then, aspire el sobrenadante y agregue 2ml de PBS para resuspender el pellet. Centrifugar la solución celular una vez más y aspirar al sobrenadante.
Ajuste la cantidad de medios basales en el tubo según sea necesario y agregue una cantidad igual de medios de congelación 2X. A continuación, transfiera las células a los viales de crioso etiquetados. Coloque los viales de crio dentro de una caja de poliestireno con una tapa para lograr una velocidad de enfriamiento lenta a 80 grados centígrados durante al menos 24 horas.
Para realizar el derribo del ARNR en las células O9-1, recupere y sembrar las células. Diluir los liposomas en un volumen adecuado de medios libres de suero. A continuación, diluir el SIRNA en medios libres de suero de acuerdo con el protocolo de texto.
Después de esto, añadir el SIRNA diluido a los liposomas diluidos, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mezclar la solución por pipeteo e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, agregue un volumen adecuado de complejo lipídico SIRNA a las células.
Luego, incubar las células durante 24 horas en una incubadora de cultivo celular estándar. Las células O9-1 pueden diferenciarse en diferentes tipos de células bajo condiciones específicas de cultivo de diferenciación. Para diferenciar las células O9-1 en osteoplastos, prepare medios de diferenciación osteogénicos de acuerdo con el protocolo de texto.
Por último, detectar el marcador osteoplasto osteocalcina en osteoplastos diferenciados por inmuno tinción. Para diferenciar las células O9-1 en células musculares lisas, cultivarlas bajo medios de diferenciación según el protocolo de texto, y evaluar la diferenciación por inmuno tinción de actina de músculo liso. En este protocolo, se realizó un experimento de nocaut y derribo para estudiar la pérdida de función de Yap en las células O9-1.
Bajo condiciones de diferenciación de células musculares lisas, la mayoría de las células de tipo salvaje O9-1 dieron lugar a la acción muscular lisa positiva células musculares lisas positivas. Las células nulas de Yap, sin embargo, generalmente no pudieron diferenciarse en células musculares lisas positivas SMA. Esto indica que Yap juega un papel crítico en la diferenciación de las células de la cresta neural en células musculares lisas.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar manejar la línea celular O9-1 con cuidado y cuidado durante todo el proceso. Asegúrese de diluir y utilizar la matriz de membrana basal correctamente, y utilizar 0.05%trypsin para la disociación celular. No olvide que durante la preparación para el cultivo celular O9-1, trabajar con mitomicina c puede ser extremadamente peligroso, y precauciones como el uso de una bata de laboratorio y guantes siempre deben tomarse durante la realización de este procedimiento.
