Метод помогает в изучении механической сигнализации клеток нервного гребня и ее взаимодействия с химическими сигналами. Это также может помочь в молекулярно-генетических механизмах развития нервного гребня при заболеваниях. Перенос стеклянных крышек является наиболее сложным, поэтому передавайте их медленно и внимательно, чтобы предотвратить их разрушение и падение.
Демонстрировать процедуру будут я и доктор Шерри Чжао, постдокторант из моей лаборатории. Начните с того, что поместите нужное количество стеклянных крышек на кусок лабораторной салфетки. Затем стерилизуйте каждую крышку, пропуская ее вперед и назад через пламя спиртовой горелки.
Когда крышка остынет, накройте 12-миллиметровый скольжение крышки примерно 200 микролитрами и 25-миллиметровое скольжение крышки 800 микролитрами 0,1 молярного гидроксида натрия. Через пять минут аспирируйте гидроксид натрия и дайте крышке высохнуть на воздухе в течение пяти минут, чтобы сформировать ровную пленку. После того, как крышка высохнет, добавьте приблизительно 18 микролитров аминопропилтриэтоксисилана или APTS на 12-миллиметровом скольжении крышки и 150 микролитров APTS на 25-миллиметровом скольжении крышки.
Аспират доступа APTS, чтобы дать остаточному APTS высохнуть в течение пяти минут. Позже промойте крышки трижды, погружая их в стерильную деионизированную воду на пять минут каждый раз. Переместите вымытую крышку на свежую чашку Петри реактивной стороной вверх.
И обработайте крышку скользящими, замочив достаточное количество 0,5% глутарового альдегида в течение 30 минут. После аспирации глутарового альдегида промойте крышку один раз деионизированной водой в течение трех минут и высушите крышку на воздухе реактивной стороной вверх. Чтобы подготовить силиконизированные крышки, поместите равное количество слипов крышки, так как эта крышка с аминосилановым покрытием скользит в чашку Петри, выстланную парапленкой.
Затем обработайте 12-миллиметровые скольжения крышки 40 микролитрами и 25-миллиметровые крышки 150 микролитрами дихлорметана силана или DCMS в течение пяти минут. Промывайте крышку стерильной деионизированной водой один раз в течение одной минуты, прежде чем поместить реактивную крышку лицевой стороной вверх на лабораторную салфетку. Для приготовления гидрогелей пипетка свежеприготовленного раствора акриламидного геля на высушенную крышку, покрытую аминосиланом.
Используя изогнутый пинцет, немедленно перенесите обработанный DCMS слип крышки поверх раствора геля с обработанной стороной, касающейся гелевого раствора, таким образом, изменяя раствор геля между двумя скользящими крышками. После полимеризации геля отделите обработанный DCMS слип крышки изогнутым пинцетом, оставив гель прикрепленным к крышке с аминосилановым покрытием. Затем погрузите 12-миллиметровый покров с прикрепленным гидрогелем в заданную 4-луночную или 24-луночную пластину, покрытую 500 микролитрами стерильной PBS или деионизированной воды, и 25-миллиметровый покровный скольжение в 6-луночную пластину, покрытую двумя миллилитрами стерильной PBS или деионизированной воды в течение 30 минут.
После удаления избытка раствора акриламида храните гидрогели в стерильной PBS или деионизированной воде комнатной температуры в течение 30 минут. Позже аспират PBS или деионизированную воду из плиты скважины перед добавлением раствора Sulfo-succinimydyl или Sulfo-SUNPAH для полного покрытия геля. И поместите гели с раствором под 15-ваттный 365-нанометровый ультрафиолетовый свет, открытый в течение 10 минут.
Соберите как можно больше сульфо-SANPAH на раствор, наклонив пластину. А затем промыть гель два-три раза 15 миллимолярами HEPES. Добавьте 15 миллиграммов на миллилитр коллагена 1, разведенного в 0,2% уксусной кислоты, в каждую лунку, содержащую гидрогель.
И инкубируйте гели в течение ночи при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. На следующий день выполните промывку, как описано в рукописи, прежде чем инкубировать гидрогели с PBS, содержащими 10% лошадиной сыворотки и 5% FBS при 37 по Цельсию и 5% углекислого газа. После двух часов инкубации добавьте 500 микролитров стерильного фильтрованного DMEM с 10% FBS и 1% пенициллина стрептомицина в каждую лунку и храните гели при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.
Когда клеточная культура будет готова, пластину примерно 1,5 раза 10 до четвертой 09-1 клетки на сантиметр в квадрате в базельной среде. Используйте пинцет для транспортировки слипов крышки на новую пластину, чтобы свести к минимуму ложные сигналы от клеток, выращенных непосредственно на пластине. Затем зафиксируйте клетки, используя 500 микролитров 4% параформальдегида в течение 10 минут, прежде чем обрабатывать клетки 500 микролитрами 0,1% тритона X-100 при комнатной температуре.
Через 15 минут пройдитесь по клеткам с 250 микролитрами 10% ослиной сыворотки. Окрашивают клетки для F-актина фелодипином в разведении от 1 до 400 в 250 микролитрах 10% ослиной сыворотки с последующей инкубацией с DAPI в течение 10 минут. Промывайте ячейки PBS в течение двух минут, прежде чем добавлять три-четыре капли монтажной среды в каждую лунку.
На флуоресцентном микроскопе захватывают изображения по меньшей мере трех случайных кадров на образец гидрогеля, производя отдельные и объединенные каналы. При оценке жесткости гидрогеля с помощью атомно-силовой микроскопии или AFM наклон кривой силы был мягким для мягких гидрогелей, поскольку требуемая сила от зонда AFM была меньше. Однако на жестких гидрогелях образовавшийся склон был намного круче.
Затем измерения AFM были использованы для расчета средней жесткости гидрогелей по модулю упругости Юнга в килопаскалях. Характеристики роста клеток Р19 и 09-1 наблюдались в одном килопаскали и 40 килопаскалях гидрогелей контрольных и модифицированных гелевых систем. Клетки 09-1, выращенные на оригинальных гелевых системах, привели к большему количеству мертвых клеток.
Напротив, клетки 09-1, выращенные на модифицированных гелевых системах, демонстрировали здоровый рост клеток и достаточное прикрепление к субстрату гидрогелей с небольшой клеточной декой, обозначенной минимальными круглыми клетками. Ячейки P19, покрытые обеими гидрогелевыми системами, показали избыток круглых плавающих клеток и отсутствие прикреплений клеточного субстрата. Совместимость клеток нервного гребня или NCC с модифицированной гидрогелевой системой оценивали иммунофлуоресцентным окрашиванием для AP-2.
Наблюдалось значительное увеличение экспрессии AP-2 в клетках 09-1, покрытых модифицированной гидрогелевой системой. Кроме того, клетки 09-1 демонстрировали различные морфологии, основанные на гидрогелях низкой или высокой жесткости через различные количества волокон напряжения. Экспрессия антивинкулина в клетках 09-1, выращенных на гидрогеле 40 килопаскалей, была выше, чем в клетках, выращенных на одном килопаскалевом гидрогеле, что отражает то, что клетки, выращенные на более мягких субстратах, образуют минимальные комплексы фокального добавления, чем жесткий субстрат.
Соответствующее время ожидания имеет решающее значение для полимеризации гидрогелей, поскольку акриламиды токсичны для клеток. Погрузите гидрогели в PBS или деионизированную воду не менее чем на 30 минут, чтобы обеспечить лучшие результаты.
