Nuestro protocolo presenta dos ensayos, cuantificando el movimiento de C.elegans. Estos métodos evalúan fenotipos de motilidad como los exhibidos por los modelos de Esclerosis Lateral Amiotrófica, o ELA. El ensayo de locomoción radial es un método rentable y fácil para detectar el rastreo en una superficie sólida.
El ensayo de natación utiliza el seguimiento basado en computadora para la detección imparcial de movimientos de golpeteo en líquido. Estos métodos son útiles para cuantificar las diferencias de movimiento en C.elegans. Aunque estudiamos la ELA, se pueden utilizar para cualquier cepa con motilidad alterada.
Voltee las placas de ensayo NGM al revés. Y etiquete la parte inferior con un identificador para las cepas de C.elegans que se van a ensayar. Haz un pequeño punto con el marcador en el centro de la placa invertida.
Mientras trabaja con un microscopio de disección, transfiera los gusanos al centro de la placa de ensayo. Y configura un temporizador durante 30 minutos. Vuelva a colocar la tapa en el plato y déjela a un lado.
Continúe transfiriendo gusanos hasta que todas las cepas estén en las placas de ensayo designadas. Después de 30 minutos, comience a anotar la primera placa retirando la tapa y colocando la placa boca abajo debajo del microscopio de disección. Ajuste el foco del microscopio hasta que todos los gusanos sean visibles a través de la barrena.
Usando un bolígrafo de punta de fieltro de diferente color desde el punto central, coloque un pequeño punto en la ubicación de cada gusano. Revise el borde de la placa, ya que algunos gusanos pueden terminar allí. Además, cuente y registre cuántos gusanos no se movieron desde el punto central.
Mida la distancia desde el punto central hasta las marcas de ubicación finales para cada gusano y registre la distancia con una regla. El primer punto de gusano está marcado con un guión. Registre los datos de longitud de cada punto consecutivamente girando la placa en el sentido de las agujas del reloj.
Abra el software asociado para configurar y grabar los videos. Haga clic en el icono de captura de vídeo. Presione la perilla del atenuador y gírela en el sentido de las agujas del reloj para ajustar la luz.
En la ventana de captura de video, haga clic en la pestaña de configuración y ajuste el modo de video a 2456x2052_Mono8, velocidad de fotogramas a 14, salida como monocromo. Exposición de 0.00300 segundos. Ganancia a 1 dB.
Gamma a uno. Y rotar a 180. Vuelva a la pestaña de captura, seleccione la carpeta de grabación y asigne un nombre de archivo ingresándolo en el cuadro de texto del prefijo de archivo.
Establezca otras configuraciones de captura como búfer, a 128 fotogramas y duración a un minuto. Coloque la placa de ensayo iluminada en el escenario del dispositivo y céntrela en la pantalla de captura de video, luego retire la tapa. Use una micropipeta para lavar aproximadamente 50 gusanos en 1 ml de M9 en la placa de ensayo.
Gire suavemente la placa para llevar a los animales al centro, o use una micropipeta para agregar unas gotas de M9 para separar a los animales. Establezca un temporizador durante 60 segundos para permitir que los gusanos se aclimaten a la natación. Ajuste la perilla de la luz de modo que la pantalla sea lo más brillante posible sin sobreexposición.
Ajuste manualmente el enfoque de la cámara girando el anillo de enfoque en el cuerpo de la lente de la cámara, mientras mira la pantalla. Después de 60 segundos, presione el botón de grabación, seleccione el primer botón en el menú de flujo de trabajo Importar secuencia de imágenes"y busque y haga doble clic en un video. En el menú de flujo de trabajo, seleccione Establecer información de secuencia"En la nueva ventana de menú, compruebe el esquema de nomenclatura, agregue notas y valide los metadatos.
Seleccione Ajustar imagen" y se abrirá un nuevo menú emergente llamado Ajustes de imagen. Ajuste la configuración de procesamiento de imágenes estableciendo el suavizado de fondo en 10, el suavizado gaussiano en cinco, Rellenar taladros en dos, el filtro de objetos pequeños en cero y omitir la segmentación derivada integral. Ajuste el nivel de umbral de modo que los animales estén completamente llenos de verde, pero aún distintos del fondo.
A continuación, haga clic en Aplicar"En el menú del flujo de trabajo, seleccione Detectar y rastrear" seleccione de tres a siete gusanos y haga clic en el botón Detectar gusanos" en la pestaña de detección. Vaya a la pestaña de seguimiento. En los parámetros de seguimiento, marque Usar retroceso" y desmarque Rastrear gusanos en el borde de la imagen.
Establezca la hipótesis máxima rastreada en cinco. Establezca el modo de seguimiento en natación. Vaya a la sección de configuración avanzada y establezca los marcos que los gusanos pueden tocar el límite en 50.
Los gusanos de marcos pueden superponerse a 500. Tolerancia de posición a 0,50. Y tolerancia de forma a 0.50.
Guarde esta configuración e impleméntela para todos los vídeos de un experimento guardándolas como configuración. Desplácese hasta el administrador de configuración en el menú del icono superior izquierdo y haga clic en el icono Guardar. Asigne a esta configuración un nombre y una descripción.
Y haga clic en Aceptar"En el menú de flujo de trabajo, haga clic en Guardar proyecto"Realizar un seguimiento de los vídeos yendo al menú de flujo de trabajo y haciendo clic en el icono Lote". Haga clic en el botón Agregar" en la sección de selección de archivos de este menú de procesamiento por lotes. desplácese hasta todos los archivos de proyecto que se van a procesar y selecciónelos.
Luego haga clic en abrir"Haga clic en el botón Inicio" y observe el indicador de progreso verde en el primer archivo. Permita que se procesen todos los archivos. Cuando todos los archivos leídos hayan terminado, cierre el software.
Seleccione Analizar datos"Desplácese hasta el resumen de la pista. Y use el botón Exportar" en la parte inferior derecha para exportar datos en un formato legible de hoja de cálculo. Utilice el recuento de giros y la duración de la pista para calcular las vueltas por minuto para cada pista mediante el uso de las funciones de hojas de cálculo.
La dispersión no estimulada de larvas L4 en etapas de desarrollo de cinco cepas diferentes se midió utilizando el ensayo de locomoción radial. Y graficado como micro medidor por minuto recorrido. Los datos que se muestran como gráficos de barras hacen que las diferencias relativas entre las cepas sean más claras.
Mientras que el desplazamiento final de cada gusano trazado dentro del gráfico, permite visualizar mejor la variación dentro de la población. Las tasas de natación en términos de frecuencia de golpeteo o ondulación en el líquido, se midieron utilizando puntuación y análisis imparciales asistidos por computadora. Y graficado como goleadas por minuto.
Los datos del gráfico de barras hacen que las diferencias relativas entre las cepas sean más fáciles de ver. Mientras que los datos de cada gusano individual puntuado se trazan dentro del gráfico, lo que permite visualizar mejor la variación dentro de la población. En el ensayo de locomoción radial, la cepa TDP-43 leve no fue significativamente diferente de la cepa N2 de tipo salvaje.
Sin embargo, en el ensayo de natación, tanto las cepas TDP-43 suaves como las fuertes no solo fueron significativamente diferentes de la N2 de tipo salvaje, sino también entre sí. La cepa TDP-43 mutante de ELA tiene un deterioro severo del gateo por locomoción radial, y no golpean en líquido. La cepa que expresa tau tiene deficiencias graves en la locomoción radial, pero puede golpear en el ensayo de natación.
El aspecto más importante a considerar con estos métodos, es mantener controles consistentes entre réplicas. Esto asegura que las variaciones en la motilidad sean causadas por diferencias fenotípicas y no por condiciones ambientales. Estos métodos proporcionan una evaluación exhaustiva de dos paradigmas principales de motilidad de C.elegans.
Los métodos de seguimiento podrían incluir caracterización conductual adicional, análisis bioquímico o investigación de la función muscular o neuronal.
