Наш протокол представляет два анализа, количественно оценивающих движение C.elegans. Эти методы оценивают фенотипы подвижности, такие как те, которые проявляются моделями бокового амиотрофического склероза или БАС. Радиальный локомоционный анализ является экономически эффективным и простым методом обнаружения ползания на твердой поверхности.
Плавательный анализ использует компьютерное отслеживание для объективного обнаружения движений в жидкости. Эти методы полезны для количественной оценки различий в движении у C.elegans. Хотя мы изучаем БАС, их можно использовать для любого штамма с измененной моторикой.
Переверните пробирные пластины NGM вверх дном. И пометьте дно идентификатором штаммов C.elegans, подлежащих анализу. Сделайте небольшую точку маркером в центре перевернутой пластины.
Во время работы с рассекающим микроскопом перенесите червей к центру пробирной пластины. И установите таймер на 30 минут. Положите крышку обратно на тарелку и отложите ее в сторону.
Продолжайте переносить червей до тех пор, пока все штаммы не окажутся на обозначенных пробирных пластинах. Через 30 минут начните забивать первую пластину, сняв крышку и поместив пластину лицевой стороной вниз под рассекающий микроскоп. Отрегулируйте фокус микроскопа до тех пор, пока все черви не будут видны через шнек.
Используя разноцветную фломастерную ручку из центральной точки, поставьте небольшую точку в месте расположения каждого червя. Проверьте край пластины, так как некоторые черви могут оказаться там. Также подсчитайте и запишите, сколько червей не двигалось от центральной точки.
Измерьте расстояние от центральной точки до конечной отметки местоположения для каждого червя и запишите расстояние с помощью линейки. Первая точка червя отмечена тире. Записывайте данные о длине для каждой точки последовательно, вращая пластину по часовой стрелке.
Откройте соответствующее программное обеспечение, чтобы настроить и записать видео. Щелкните значок захвата видео. Нажмите на ручку диммера и поверните ее по часовой стрелке, чтобы отрегулировать свет.
В окне захвата видео нажмите на вкладку настроек и настройте режим видео на 2456x2052_Mono8, частоту кадров до 14, выход как монохромный. Экспозиция 0.00300 секунд. Коэффициент усиления до 1 дБ.
Гамма к единице. И повернуть до 180. Вернитесь на вкладку захвата, выберите папку записи и назначьте имя файла, введя его в текстовое поле префикса файла.
Установите для других параметров захвата, таких как буфер, значение 128 кадров и продолжительность в одну минуту. Поместите подсвеченную пробирную пластину на сцене устройства и центрируйте ее на экране видеозахвата, затем снимите крышку. Используйте микропипетку, чтобы вымыть около 50 червей в 1 мл M9 на пробирную пластину.
Осторожно закрутите пластину, чтобы привести животных к центру, или используйте микропипетку, чтобы добавить несколько капель M9, чтобы отделить животных. Установите таймер на 60 секунд, чтобы позволить червям акклиматизироваться к плаванию. Отрегулируйте световую ручку таким образом, чтобы дисплей был как можно ярче без передержки.
Вручную отрегулируйте фокусировку камеры, повернув кольцо фокусировки на корпус объектива камеры во время наблюдения за дисплеем. Через 60 секунд нажмите кнопку записи, выберите первую кнопку в меню рабочего процесса «Импорт последовательности изображений» и найдите и дважды щелкните по видео. В меню рабочего процесса выберите Задать сведения о последовательности"В новом окне меню проверьте схему именования, добавьте заметки и проверьте метаданные.
Выберите «Настроить изображение», и откроется новое всплывающее меню под названием «Коррекция изображения». Настройте параметры обработки изображений, установив для параметра сглаживание фона значение 10, гауссовское сглаживание до пяти, для заполнения отверстий до двух, для фильтра малых объектов до нуля и пропуская сегментацию интегральной производной. Отрегулируйте пороговый уровень так, чтобы животные были полностью заполнены зеленым, но все же отличались от фона.
Затем нажмите «Применить»В меню рабочего процесса выберите «Обнаружить и отслеживать», выберите от трех до семи червей и нажмите кнопку «Обнаружить червей» на вкладке обнаружения. Перейдите на вкладку отслеживания. В параметрах отслеживания установите флажок Использовать Backtracking" и снимите флажок Отслеживать червей на краю изображения.
Установите для максимальной отслеживаемой гипотезы значение пять. Установите режим отслеживания на плавание. Перейдите в раздел дополнительных настроек и установите для кадров, черви могут коснуться границы на 50.
Рамки червей могут перекрываться до 500. Допуск положения до 0,50. А допуск формы до 0,50.
Сохраните эти параметры и разверните их для всех видео в эксперименте, сохранив их в виде конфигурации. Перейдите в диспетчер конфигураций в верхнем левом меню значков и нажмите на значок Сохранить". Присвойте этой конфигурации имя и описание.
И нажмите Ok"В меню рабочего процесса нажмите Сохранить проект"Отслеживать видео, перейдя в меню рабочего процесса и щелкнув значок Пакет". Нажмите кнопку Добавить" в разделе выбора файла этого меню пакетной обработки. перейдите и выберите все файлы проекта для обработки.
Затем нажмите кнопку «Открыть», нажмите кнопку «Пуск» и запишите зеленый индикатор прогресса на первом файле. Разрешить обработку всех файлов. Когда все прочитанные файлы будут завершены, закройте программное обеспечение.
Выберите Анализ данных"Перейдите к сводке трека. И используйте кнопку «Экспорт» в правом нижнем углу для экспорта данных в формате электронной таблицы. Используйте «Количество поворотов» и «Длительность трека» для расчета оборотов в минуту для каждого трека с помощью функций электронных таблиц.
Нестимулированная дисперсия стадии развития личинки L4 пяти различных штаммов была измерена с использованием радиального локомоционного анализа. И на графике, как микрометр в минуту путешествия. Данные, отображаемые в виде гистограмм, делают относительные различия между штаммами более четкими.
В то время как окончательное смещение каждого червя, нанесенного на график, позволяет лучше визуализировать вариации внутри популяции. Показатели плавания с точки зрения частоты метания или волнения в жидкости измерялись с использованием непредвзятого компьютерного подсчета и анализа. И график в виде трэшей в минуту.
Данные гистограммы облегчают просмотр относительных различий между штаммами. Принимая во внимание, что данные от каждого отдельного оцененного червя отображаются на графике, что позволяет лучше визуализировать вариации в популяции. В радиальном локомоционном анализе мягкий штамм TDP-43 существенно не отличался от штамма N2 дикого типа.
Однако в плавательном анализе как мягкие, так и сильные штаммы TDP-43 значительно отличались не только от дикого типа N2, но и друг от друга. Мутантный штамм ALS TDP-43 имеет серьезные нарушения ползания радиальной локомоцией, и они не трясутся в жидкости. Тау-экспрессирующий штамм имеет серьезные нарушения в радиальной локомоции, но может колебаться в плавательном анализе.
Наиболее важным аспектом, который следует учитывать при использовании этих методов, является поддержание согласованного контроля между репликациями. Это гарантирует, что изменения подвижности вызваны фенотипическими различиями, а не условиями окружающей среды. Эти методы обеспечивают всестороннюю оценку двух основных парадигм подвижности C.elegans.
Методы наблюдения могут включать дополнительную поведенческую характеристику, биохимический анализ или исследование функции мышц или нейронов.
