Nosso protocolo apresenta dois ensaios, quantificando o movimento de C.Elegans. Esses métodos avaliam fenótipos de motilidade, como os expostos por modelos de Esclerose Lateral Amiotrófica, ou ELA. O Ensaio de Locomoção Radial é um método econômico e fácil de detectar rastreamento em uma superfície sólida.
O Ensaio de Natação usa rastreamento baseado em computador para detecção imparcial de movimentos de thrashing em líquido. Estes métodos são úteis para quantificar diferenças de movimento em C.elegans. Embora estudemos ELA, elas podem ser usadas para qualquer cepa com motilidade alterada.
Vire as placas de ensaio NGM de cabeça para baixo. E rotule a parte inferior com um identificador para as cepas C.elegans a serem avaliadas. Faça um pequeno ponto com o marcador no centro da placa de cabeça para baixo.
Enquanto trabalha com um microscópio dissecando, transfira vermes para o centro da placa de ensaio. E reserve um temporizador por 30 minutos. Coloque a tampa de volta na placa e reserve-a.
Continue transferindo vermes até que todas as cepas estejam nas placas de ensaio designadas. Após 30 minutos, comece a marcar a primeira placa removendo a tampa e colocando a placa de frente para baixo sob o microscópio de dissecação. Ajuste o foco do microscópio até que todos os vermes sejam visíveis através do Auger.
Usando uma caneta de ponta de feltro colorida diferente do ponto central, coloque um pequeno ponto na localização de cada verme. Verifique a borda da placa como alguns vermes podem acabar lá. Além disso, conte e regise quantos vermes não se moveram do ponto central.
Meça a distância do ponto central até as marcas finais de localização de cada verme e regissão a distância usando uma régua. O primeiro ponto de verme é marcado com um traço. Registo os dados de comprimento de cada ponto consecutivamente girando a placa de forma no sentido horário.
Abra o software associado para configurar e gravar os vídeos. Clique no ícone de captura de vídeo. Pressione para baixo o botão dimmer e gire-o no sentido horário para ajustar a luz.
Na janela de captura de vídeo, clique na guia de configurações e ajuste o modo de vídeo para 2456x2052_Mono8, taxa de quadros para 14, saída como monocromática. Exposição de 0,00300 segundos. Ganhe para 1 dB.
Gamma para um. E gire para 180. Volte para a guia de captura, selecione a pasta de gravação e atribua um nome de arquivo inserindo-o na caixa de texto prefixo do arquivo.
Defina outras configurações de captura, como buffer, para 128 quadros e duração de um minuto. Coloque a placa de ensaio acesa no palco do dispositivo e centralize-a na tela de captura de vídeo e, em seguida, remova a tampa. Use uma micropipette para lavar cerca de 50 vermes em 1 ml de M9 na placa de ensaio.
Gire suavemente a placa para levar os animais ao centro, ou use uma micropipette para adicionar algumas gotas de M9 para separar os animais. Defina um temporizador por 60 segundos para permitir que os vermes se aclimatem à natação. Ajuste o botão de luz de modo que o display seja o mais brilhante possível sem superexposição.
Ajuste manualmente o foco da câmera girando o anel de foco no corpo da lente da câmera, enquanto observa o display. Após 60 segundos pressione o botão de gravação, selecione o primeiro botão no menu de fluxo de trabalho Import Image Sequence" e encontre e clique duas vezes em um vídeo. No menu de fluxo de trabalho selecione Definir informações de sequência"Na nova janela do menu verifique o esquema de nomeação, adicione notas e valide metadados.
Selecione Ajustar imagem e um novo menu pop-up chamado Ajustes de Imagem será aberto. Ajuste as configurações de processamento de imagem definindo a suavização do fundo para 10, suavização gaussiana para cinco, Encha os orifícios para dois, filtro de objeto pequeno a zero e pulando a Segmentação Derivativa Integral. Ajuste o nível de limiar de modo que os animais estejam completamente cheios de verde, mas ainda distintos do fundo.
Em seguida, clique em Aplicar"No menu fluxo de trabalho, selecione Detectar e Rastrear"selecione de três a sete worms e clique no botão Detectar worms" na guia de detecção. Mova-se para a guia de rastreamento. Nos parâmetros de rastreamento, verifique o backtracking "e desmarque os worms de rastreamento na borda da imagem.
Coloque a hipótese máxima rastreada para cinco. Defina o modo de rastreamento para nadar. Mova-se para a seção de configurações avançadas e ajuste os quadros que os worms podem tocar o limite para 50.
Os worms de quadros podem se sobrepor a 500. Tolerância de posição a 0,50. E forma tolerância a 0,50.
Salve essas configurações e implante-as para todos os vídeos em um experimento, salvando-as como uma configuração. Navegue até o gerenciador de configurações no menu de ícone superior esquerdo e clique no ícone Salvar". Dê a esta configuração um nome e uma descrição.
E clique em "Ok" No menu de fluxo de trabalho, clique em Salvar projeto"Acompanhe os vídeos indo para o menu de fluxo de trabalho e clicando no ícone Batch". Clique no botão Adicionar"na seção de seleção de arquivos deste menu de processamento em lote. navegar e selecionar todos os arquivos do projeto a serem processados.
Em seguida, clique em Abrir o botão "Iniciar" e observe o indicador de progresso verde no primeiro arquivo. Permita que todos os arquivos sejam processados. Quando todos os arquivos lidos terminarem, feche o software.
Selecione Analisar dados"Navegue até o resumo da faixa. E use o botão Exportar na parte inferior direita para exportar dados em um formato legível de planilha. Use a Contagem de giros e duração da faixa para calcular as voltas por minuto para cada faixa no uso de funções de folha de difusão.
A dispersão não estimulada da larva L4 encenada pelo desenvolvimento de cinco cepas diferentes foi medida usando o Ensaio de Locomoção Radial. E grafado como micro medidor por minuto viajou. Os dados exibidos como gráficos de barras tornam mais claras as diferenças relativas entre as cepas.
Considerando que o deslocamento final de cada verme traçado dentro do gráfico permite que a variação dentro da população seja melhor visualizada. As taxas de natação em termos de frequência de desarmamento ou ondulação no líquido, foram medidas utilizando-se pontuação e análise imparcial assistida por computador. E grafados como thrashes por minuto.
Os dados do gráfico da barra tornam mais fáceis de ver diferenças relativas entre as cepas. Considerando que os dados de cada verme individual obtidos são traçados dentro do gráfico, permitindo que a variação dentro da população seja melhor visualizada. No ensaio de locomoção radial, a leve cepa TDP-43 não foi significativamente diferente da cepa N2 do tipo selvagem.
No entanto, no Ensaio de Natação, tanto as cepas suaves quanto fortes de TDP-43 não eram apenas significativamente diferentes do N2 tipo selvagem, mas também umas das outras. A cepa TDP-43 mutante da ALS tem grave comprometimento de rastreamento pela Locomoção Radial, e eles não batem em líquido. A tensão de expressão de tau tem graves prejuízos na Locomoção Radial, mas pode bater no Ensaio de Natação.
O aspecto mais importante a ser considerado com esses métodos é manter controles consistentes entre as réplicas. Isso garante que as variações na motilidade sejam causadas por diferenças fenotípicas e não ambientais. Esses métodos fornecem uma avaliação abrangente de dois grandes paradigmas de motilidade c.elegans.
Métodos de acompanhamento podem incluir caracterização comportamental adicional, análise bioquímica ou investigação da função muscular ou neurônio.
