Il nostro protocollo presenta due saggi, quantificando il movimento di C.elegans. Questi metodi valutano fenotipi di motilità come quelli esibiti da modelli di sclerosi laterale amiotrofica o SLA. Il test di locomozione radiale è un metodo economico e semplice per rilevare la strisciatura su una superficie solida.
Il Swimming Assay utilizza il tracciamento basato su computer per il rilevamento imparziale dei movimenti di thrashing nel liquido. Questi metodi sono utili per quantificare le differenze di movimento in C.elegans. Sebbene studiamo la SLA, possono essere utilizzati per qualsiasi ceppo con motilità alterata.
Capovolgere le piastre di analisi NGM a testa in giù. Ed etichettare il fondo con un identificatore per i ceppi di C.elegans da analizzare. Crea un piccolo punto con il pennarello al centro della piastra capovolta.
Mentre si lavora con un microscopio di dissezione, trasferire i vermi al centro della piastra di analisi. E imposta un timer per 30 minuti. Rimettere il coperchio sul piatto e metterlo da parte.
Continuare a trasferire i vermi fino a quando tutti i ceppi non si trovano sulle piastre di dosaggio designate. Dopo 30 minuti, iniziare a segnare la prima piastra rimuovendo il coperchio e posizionando la piastra a faccia in giù sotto il microscopio di dissezione. Regolare la messa a fuoco del microscopio fino a quando tutti i vermi sono visibili attraverso la coclea.
Usando un pennarello di colore diverso dal punto centrale, metti un piccolo punto nella posizione di ciascun verme. Controlla il bordo del piatto poiché alcuni vermi potrebbero finire lì. Inoltre, conta e registra quanti worm non si sono spostati dal punto centrale.
Misurare la distanza dal punto centrale ai contrassegni di posizione finali per ogni worm e registrare la distanza utilizzando un righello. Il primo punto worm è contrassegnato da un trattino. Registrare i dati di lunghezza per ogni punto consecutivamente ruotando la piastra in senso orario.
Apri il software associato per configurare e registrare i video. Fare clic sull'icona di acquisizione video. Premere verso il basso sulla manopola del dimmer e ruotarla in senso orario per regolare la luce.
Nella finestra di acquisizione video, fai clic sulla scheda Impostazioni e regola la modalità video per 2456x2052_Mono8, frequenza fotogrammi a 14, output monocromatico. Esposizione di 0,00300 secondi. Guadagno a 1 dB.
Gamma a uno. E ruota a 180. Tornare alla scheda acquisizione, selezionare la cartella di registrazione e assegnare un nome di file immettendolo nella casella di testo prefisso file.
Imposta altre impostazioni di acquisizione come buffer, su 128 fotogrammi e durata su un minuto. Posizionare la piastra di analisi illuminata sul palco del dispositivo e centrarla nella schermata di acquisizione video, quindi rimuovere il coperchio. Utilizzare una micropipetta per lavare circa 50 vermi in 1 ml di M9 sulla piastra di dosaggio.
Ruotare delicatamente la piastra per portare gli animali al centro o utilizzare una micropipetta per aggiungere alcune gocce di M9 per separare gli animali. Imposta un timer per 60 secondi per consentire ai vermi di acclimatarsi al nuoto. Regolare la manopola della luce in modo che il display sia il più luminoso possibile senza sovraesposizione.
Regolare manualmente la messa a fuoco della fotocamera ruotando la ghiera di messa a fuoco sul corpo dell'obiettivo della fotocamera, mentre si guarda il display. Dopo 60 secondi premere il pulsante di registrazione, selezionare il primo pulsante nel menu del flusso di lavoro Importa sequenza immagine"e trovare e fare doppio clic su un video. Dal menu del flusso di lavoro selezionare Imposta informazioni sequenza"Nella finestra nuovo menu controllare lo schema di denominazione, aggiungere note e convalidare i metadati.
Seleziona Regola immagine"e si aprirà un nuovo menu a comparsa chiamato Regolazioni immagine". Regola le impostazioni di elaborazione delle immagini impostando l'arrotondamento dello sfondo su 10, l'arrotondamento gaussiano su cinque, i fori di riempimento su due, il filtro oggetto piccolo a zero e saltando la segmentazione derivata integrale. Regola il livello di soglia in modo che gli animali siano completamente pieni di verde, ma ancora distinti dallo sfondo.
Quindi fare clic su Applica"Dal menu del flusso di lavoro, selezionare Rileva e traccia" selezionare da tre a sette worm e fare clic sul pulsante Rileva worm nella scheda di rilevamento. Passare alla scheda di monitoraggio. Nei parametri di tracciamento selezionare Usa backtracking" e deselezionare Traccia worm sul bordo dell'immagine.
Impostare l'ipotesi massima tracciata su cinque. Imposta la modalità di tracciamento sul nuoto. Passare alla sezione delle impostazioni avanzate e impostare i frame worm possono toccare il limite su 50.
I worm dei frame possono sovrapporsi a 500. Tolleranza di posizione a 0,50. E tolleranza di forma a 0,50.
Salva queste impostazioni e distribuiscile per tutti i video di un esperimento salvandole come configurazione. Passare a Gestione configurazione nel menu dell'icona in alto a sinistra e fare clic sull'icona Salva. Assegnare a questa configurazione un nome e una descrizione.
E fai clic su OK"Nel menu del flusso di lavoro, fai clic su Salva progetto"Traccia i video andando al menu del flusso di lavoro e facendo clic sull'icona Batch". Fare clic sul pulsante Aggiungi" nella sezione di selezione dei file di questo menu di elaborazione batch. individuare e selezionare tutti i file di progetto da elaborare.
Quindi fare clic su Apri"Fare clic sul pulsante Start" e annotare l'indicatore di avanzamento verde sul primo file. Consentire l'elaborazione di tutti i file. Al termine di tutti i file letti, chiudere il software.
Seleziona Analizza dati"Passare al riepilogo della traccia. E usa il pulsante Esporta" in basso a destra per esportare i dati in un formato leggibile da un foglio di calcolo. Usa il conteggio dei giri e la durata della traccia per calcolare i giri al minuto per ogni traccia utilizzando le funzioni di foglio di calcolo.
La dispersione non stimolata della larva L4 in fase di sviluppo di cinque diversi ceppi è stata misurata utilizzando il radiale locomozione. E rappresentato graficamente come micro metro al minuto viaggiato. I dati visualizzati come grafici a barre rendono più chiare le differenze relative tra i ceppi.
Mentre lo spostamento finale di ogni verme tracciato all'interno del grafico, consente di visualizzare meglio la variazione all'interno della popolazione. I tassi di nuoto in termini di frequenza di thrashing o ondulazione nel liquido, sono stati misurati utilizzando punteggi e analisi imparziali assistiti da computer. E rappresentato graficamente come thrash al minuto.
I dati del grafico a barre rendono più facili da vedere le differenze relative tra i ceppi. Mentre i dati di ogni singolo worm segnato sono tracciati all'interno del grafico, consentendo di visualizzare meglio la variazione all'interno della popolazione. Nel Radial Locomotion Assay, il ceppo TDP-43 lieve non era significativamente diverso dal ceppo N2 wild-type.
Tuttavia, nel Swimming Assay, sia i ceppi TDP-43 lievi che quelli forti non erano solo significativamente diversi dal wild-type N2, ma anche l'uno dall'altro. Il ceppo mutante della SLA TDP-43 ha una grave compromissione strisciante da parte della locomozione radiale e non si agita nel liquido. Il ceppo che esprime la tau ha gravi menomazioni nella locomozione radiale, ma può colpire nel test di nuoto.
L'aspetto più importante da considerare con questi metodi è il mantenimento di controlli coerenti tra le repliche. Ciò garantisce che le variazioni della motilità siano causate da differenze fenotipiche e non da condizioni ambientali. Questi metodi forniscono una valutazione completa di due principali paradigmi di motilità di C.elegans.
I metodi di follow-up potrebbero includere un'ulteriore caratterizzazione comportamentale, analisi biochimica o indagine sulla funzione muscolare o neuronale.
