La angiogénesis desempeña un papel importante en la metástasis y progresión tumoral. En este protocolo, utilizaremos el método de imágenes de bioluminiscencia dual para monitorear la progresión tumoral dinámica y la angiogénesis en un modelo de ratón de cáncer de mama. En este modelo, podemos rastrear el crecimiento tumoral y la angiogénesis simultáneamente en el solo ratón a través de firefly luciferase y Renilla luciferase imaging, respectivamente.
Este modelo puede aplicarse ampliamente en la investigación de detección de fármacos antitumorales y oncología. Este modelo dual de bioluminiscencia se puede utilizar para realizar un seguimiento de la progresión y regresión tumoral y para detectar procesos moleculares relacionados con tumores en respuesta a estrategias terapéuticas. La angiogénesis es un proceso crucial de progresión tumoral.
Por lo tanto, es necesario controlar la progresión tumoral y la angiogénesis de manera visual y sensible para desarrollar tratamientos tumorales eficaces. Los procedimientos serán demostrados por Kaiyue Zhang, Chen Wang y Shang Chen, estudiantes de nuestro laboratorio. Para el envasado y la producción de lentivirus de una a la 10 a la sexta de las células 293T en dos mililitros de DMEM complementados con un 10% de suero bovino fetal por pozo en una placa de seis pozos para cultivo nocturno en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono.
A la mañana siguiente mezcla 7,5 microlitros de liposoma con 250 microlitros de Minimal Essential Medium en dos tubos separados de 1,5 mililitros para una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente. Para preparar las soluciones de ADN añadir el vector de lentivirus RR plásmido de plásmido y plásmidos auxiliares de plásmido a 250 microlitros de Minimal Essential Medium en tubos individuales de 1,5 mililitros como se describe en la tabla. Al final de la incubación añadir suavemente las soluciones de ADN RR a las suspensiones liposomas de una manera gota y permitir que el ADN se una a las membranas lipídicas durante 20 minutos a temperatura ambiente.
Mientras la mezcla está incubando, reemplace el sobrenadante del cultivo celular 293T con un mililitro de medio de cultivo fresco, y agregue suavemente 0,5 mililitros de la mezcla de ADN liposoma apropiada a cada pozo. Devolver las células a la incubadora de cultivo celular durante 12 a 16 horas antes de reemplazar el sobrenadante en cada pozo con un mililitro de medio de cultivo fresco complementado con antibióticos. Después de 36 horas adicionales de incubación, acomoda los sobrenadantes en un tubo cónico por cepa de lentivirus para sedimentar las células 293T por centrifugación.
A continuación, transfiera los sobrenadantes que contienen lentivirus RR a tubos individuales de almacenamiento de polipropileno estéril de 1,5 mililitros para su almacenamiento a menos 80 grados centígrados. Para la transducción lentiviral para la expresión génica en células tumorales mamarias 4T1, reemplace el sobrenadante en cada pozo de una placa de cultivo celular de seis pozos 4T1 por un mililitro de medio de cultivo celular fresco basado en RPMI complementado con suero bovino fetal y un mililitro de caldo lentiviral. A continuación, agregue ocho microgramos por mililitro de polibroo a cada pocóter, y pipetee suavemente unas cuantas veces para mezclar.
Centrifugar la placa para ayudar a aumentar la eficiencia de la transducción, y devolver las células a la incubadora de cultivo celular durante cuatro a 12 horas. Al final de la incubación, reemplazar el sobrenadante en cada pozo con medio de cultivo fresco complementado con suero y antibióticos para eliminar cualquier partícula lentiviral y Polybrene. Para seleccionar las células transducidas por lentivirus, pasaje los cultivos celulares 4T1 transducidos en una relación de uno a tres a uno a cuatro con el medio de selección, cambiando el medio cada dos a tres días.
Después de siete días de cultivo medio de selección, vea los cultivos celulares transducidos bajo un microscopio de contraste de fase invertida de fluorescencia y cuente el número de células de proteína fluorescente roja positivas o RFP-4T1 y todas las células 4T1 en tres campos de visión para estimar la relación RFP-positiva. Para configurar un modelo de ratón portador de tumores, lave 80%cultivos celulares transducidos con pbS antes de separar las células con dos mililitros de trippsina-EDTA por placa de cultivo de 60 milímetros. Cuando las células se han levantado de los fondos de la placa detener la reacción con cinco a 10 mililitros de suero suplementado medio por placa.
Y transferir las culturas a tubos de centrífuga individuales de 15 mililitros para contar. Diluir las células a una vez 10 a la sexta célula por cada 100 microlitros de medio de cultivo sin concentración sérica. E inyecte por vía subcutánea 100 microlitros de la línea celular 4T1-RR en el hombro izquierdo de un ratón modelo anestesado portador de tumor, y 100 microlitros de la línea celular 4T1-RRT en el hombro derecho del mismo ratón.
Después de las inyecciones, coloque cada ratón en un área de recuperación adecuada con un soporte térmico hasta que se recupere por completo. Palpa las masas tumorales todos los días durante siete días para confirmar que los ratones son portadores de tumores. En el día siete postimplantación, inyectar por vía intraperitoneal 50 microgramos por kilogramo de Ganciclovir en cada ratón portador de tumor dos veces al día hasta el final del experimento.
Para el crecimiento del tumor, abra el Sistema de Imágenes Vivientes. Inicializar el software Living Imaging e inicializar el sistema. Mientras el sistema se está inicializando, utilice una jeringa de insulina para inyectar cada ratón para obtener una imagen del volumen adecuado de coelenterazina en el retrobulbar.
Coloque los ratones inyectados en la cámara de la cámara e inmediatamente obtenga varias imágenes del ratón dorsalmente para adquirir las señales de Renilla luciferase de las células 4T1 hasta que las señales bioluminiscentes se desvanezcan. 10 minutos después de la toma de imágenes de Renilla luciferase, utilice una jeringa de insulina para inyectar por vía intraperitoneal el volumen adecuado de D-luciferina en cada animal. 10 minutos después de la inyección de D-luciferina, coloque los ratones en la cámara de la cámara y obtenga varias imágenes de la dorsal del ratón para adquirir las señales de Firefly luciferase de la angiogénesis.
Después de la transducción del lentivirus, más del 99% de las células son RFP-positivas sin diferencias en la morfología del cultivo celular observada entre las dos líneas celulares transducidas. Posteriormente, las imágenes de bioluminiscencia de las células transducidas revelan que ambas líneas celulares emiten señales bioluminiscentes fuertes de una fuerza similar. Después de la inyección subcutánea de las líneas celulares transducidas en un modelo de ratón portador de tumor transgénico, el crecimiento tumoral inducido por la angiogénesis puede ser evaluado por señales de Firefly luciferase en presencia de D-luciferina en el mismo animal.
A los siete días después de la implantación, la administración de Ganciclovir induce la muerte en las células 4T1-RRT, lo que resulta en una reducción dramática de la señal de Renilla luciferase en los tumores establecidos por estas células. Las señales de luciferasa de luciérnculo también aumentan junto con un aumento en la expresión de renilla luciferasa y disminución después de la disminución de la luciferasa. En conjunto, estos resultados sugieren que existe una correlación directa entre la angiogénesis tumoral y el crecimiento tumoral.
De hecho, la muerte de células tumorales inducida por Ganciclovir puede conducir a una inhibición de la angiogénesis tumoral. Además, la inmunostaining para el receptor II del factor de crecimiento endotelial anti-vascular, como marcador de angiogénesis, revela una estructura microvascular más significativamente establecida en las secciones del tejido tumoral 4T1-RR que en secciones de tumores 4T1-RRT, consistente con la disminución de la señal de Firefly luciferasa observada después de la administración de Ganciclovir. El paso más crítico del protocolo es el uso de dos tipos de luciferasa, como FLuc y RLuc para el seguimiento simultáneo de las células y la angiogénesis.
Esta tecnología podría ser utilizada para tratar las células cancerosas dentro de diferentes lugares, y se puede utilizar ampliamente en modelos de cáncer de virus. Este modelo de ratón permite visualizar dinámicamente el crecimiento tumoral y los efectos antitumorales del sistema de seguimiento HSV-ttk/GCV en un animal vivo. Se requiere una instalación de nivel II de bioseguridad para prevenir una transfección de lentivirus, ya que los medios contienen partículas de lentivirus que podrían ser perjudiciales para los seres humanos.
