La técnica Flow-Enhanced Ultrasound nos permite obtener imágenes de la vasculatura del ojo en tres dimensiones, sin el uso de agentes de contraste. La principal ventaja de esta técnica es su estabilidad para obtener imágenes de la vestura, detrás de la retina pigmentada, lo que es un desafío con varias técnicas de imagen óptica. Demostramos esta técnica en peces de colores, pero se puede aplicar a todas las especies con glóbulos rojos nucleados, lo que permite a los investigadores obtener información sobre la evolución funcional de los ojos.
Esta técnica puede ser aplicada por investigadores con formación básica en ecografía y manejo de animales. Después de confirmar un nivel óptimo de anestesia, coloque al animal en una postura que permita el acceso directo desde arriba al ojo. Coloque un medio de ultrasonido adecuado en el ojo del animal.
Si los párpados escamosos cubren el ojo, entonces, desplace estos suavemente con un hisopo de algodón. Para los animales acuáticos, el agua funciona bien como un medio de ultrasonido, A continuación, coloque el transductor de ultrasonido, medial al ojo, ya sea en una orientación caudal dorsal ventral o rostral, dependiendo de la orientación de la imagen deseada. En el modo B, con una profundidad de campo máxima, imagine la parte medial y más profunda del ojo, para asegurarse de que todas las estructuras de interés sean visibles en el campo de la imagen.
Traduzca lentamente el transductor a cada lado, mientras inspecciona las imágenes en tiempo real. Asegúrese de que todas las estructuras de interés sean visibles en el campo de la imagen. De lo contrario, cambie a un transductor con una frecuencia más baja y una mayor profundidad de campo.
Ajuste la profundidad de la imagen, el desplazamiento de profundidad, el ancho de la imagen y el número de posiciones de las zonas focales para cubrir la región de interés deseada en las tres dimensiones espaciales. A continuación, establezca la velocidad de fotogramas en el rango de 50 a 120 fotogramas por segundo. A continuación, ajuste la ganancia 2D a un nivel, de modo que las estructuras anatómicas solo sean visibles en la adquisición del modo B para aumentar la relación señal/ruido en la posterior reconstrucción mejorada por el flujo.
Para adquirir una imagen mejorada con flujo 2D en una sola posición de corte, traduzca el transductor a esta posición y proceda a la reconstrucción de imagen mejorada por flujo. Para adquirir una grabación 3D de toda una región de interés, traduzca el transductor a un extremo de la región de interés. Para determinar la posición exacta del extremo extremo, aumente la ganancia 2D, brevemente.
Después de colocar correctamente el transductor, reduzca la ganancia 2D antes de grabar, para garantizar la máxima relación señal/ruido en la posterior reconstrucción mejorada del flujo. Por cada paso o slice en la grabación 3D, adquiere más de 100 fotogramas. Luego, utilizando un micromanipulador o un motor de transductor incorporado, traduzca el transductor en toda la región de interés, en pasos de 25 o 50 micrómetros, y repita la adquisición de más de 100 cuadros para cada paso.
Para la construcción de imágenes mejoradas por flujo, exporte las grabaciones al formato de archivo DICOM. Para producir una sola imagen mejorada de flujo basada en una grabación de escena superior a 100 fotogramas, calcule la desviación estándar en un nivel de píxel utilizando esta fórmula y repita el cálculo para cada segmento en la grabación 3D. Para automatizar el cálculo de la desviación estándar y el proceso de reconstrucción de imágenes para múltiples segmentos en una grabación 3D, realice esta operación en modo por lotes utilizando ImageJ y el script de macros, proporcionado en el manuscrito de texto.
Combine todas las imágenes reconstruidas en una pila de imágenes mediante el comando Imágenes para apilar en ImageJ. A continuación, mediante el comando Propiedades, especifica el grosor de la división a partir del tamaño de paso utilizado durante la adquisición y guarda la pila de imágenes como un archivo TIFF 3D. La presencia de glóbulos rojos nucleados en vertebrados mamíferos adultos no ad proporciona un contraste positivo de la sangre que fluye, en comparación con el tejido estático en las grabaciones de escenas.
Sin embargo, cuando ahora se analiza fotograma a fotograma, la clara distinción entre la sangre y el tejido circundante es menos obvia. Este procedimiento de mejora del flujo sanguíneo, esencialmente, compila un registro de puntos de tiempo múltiples en el espacio 2D, en una sola imagen, donde en la fluctuación inherente del valor de la señal en píxeles, posicionados en la sangre que fluye, obtienen una desviación estándar más alta que el tejido estático circundante, produciendo un contraste positivo. En las adquisiciones 3D, se pueden combinar múltiples segmentos paralelos con espaciado conocido en datos de imágenes 3D.
Se puede utilizar para la representación de volúmenes tridimensionales y el modelado anatómico. Sin embargo, las imágenes de ultrasonido basadas en Doppler también brindan la opción de obtener imágenes específicas del flujo sanguíneo con menos sensibilidad que este método. Este procedimiento de ultrasonido de flujo mejorado permite imágenes de flujo sanguíneo en una variedad de especies con glóbulos rojos nucleados.
Los lechos vasculares oculares profundos, como la coroides rete mirabile en algunos peces, se pueden visualizar si están presentes en la especie. El método está limitado por la ausencia de glóbulos rojos nucleados en mamíferos, en los que el procedimiento de mejora del flujo produce cierto grado de contraste del flujo sanguíneo, pero no tan distinto como en las especies con glóbulos rojos nucleados. El ultrasonido de flujo mejorado es sensible al ruido de movimiento.
Los movimientos respiratorios pueden causar desenfoque de la imagen y artefactos, como la mejora del borde del tejido. La apertura prospectiva o retrospectiva se puede utilizar para ajustar el ruido de movimiento. Tanto para las adquisiciones 2D como para las 3D, es crucial limitar los artefactos de movimiento causados por el movimiento del animal, debido a la anestesia inadecuada en la configuración inestable del transductor.
El desarrollo de esta técnica, allanó el camino para el examen in vivo no invasivo de las redes vasculares profundas en el ojo de la gran mayoría de los vertebrados, que poseen eritrocitos nucleados.
